A genetic analysis to elucidate the function of the Plasmodium falciparum parasitophorous vacuole protein, PfPV1

Zusammenfassung Die Malaria ist noch immer eine der verheerendsten Infektionskrankheiten weltweit. Das Verständnis der Biologie des ihr zugrunde liegenden Pathogens, Plasmodium falciparum ist notwendig, um erfolgreich gegen diese Krankheit vorzugehen. Dabei ist die Genese und Aufrechterhaltung der parasitophoren Vakuole (PV) innerhalb des Erythrozyten ein essentieller Faktor für das Überleben des Parasiten. Obwohl diese grundlegende Bedeutung für den Parasiten bekannt ist, bleibt die genaue Zusammensetzung und die Funktion vieler Bestandteile der PV weiter ungeklärt. Unsere Gruppe hat dabei das erste Proteom dieses Kompartiments veröffentlicht und in der Vergangenheit weitere Komponenten desselben identifiziert. PfPV1 ist eines dieser neu entdeckten Proteine. Um Informationen bezüglich der Funktion dieses Proteins gewinnen zu können, wurde in der vorliegenden Arbeit eine Knock-out Strategie gewählt. Zudem wurde versucht, Interaktionspartner von PfPV1 mit Hilfe von GST Pull-Down Assays zu identifizieren. Beim ersten Versuch des Knock-outs wurde eine Double-Crossover Strategie mit negativer Selektion verfolgt, wobei sich der erhaltene Knock-out Parasit nicht weiter kultivieren ließ. Die Integration in den PfPV1- Lokus war jedoch erfolgreich und so wurde bei der spezifischen Southern-Blot Hybridisierung sowohl eine endogene als auch eine Knock- Out Bande detektiert. Die Schlussfolgerung aus diesen Ergebnissen ist, dass PfPV1 für das Überleben des Parasiten in-vitro essentiell ist, und dass im Zuge der Integration in den endogenen Lokus eine Duplikation stattgefunden haben muss, welche die weitere Expression des Gens sichergestellt hat. Die obige Annahme wurde durch die Ergebnisse der zweiten Knock-Out Strategie weiter bestätigt. Hierbei wurde versucht, das endogene Gen mit Hilfe eines Knock- Out Vektors zu zerstören, während gleichzeitig PfPV1 unter der Kontrolle eines fremden Promotors von einem episomalen Plasmid exprimiert wird, welches nicht fähig ist mit dem endogenen Lokus zu rekombinieren. Jedoch ließ sich auch mit Hilfe dieses Ansatzes das PfPV1-Gen nicht zerstören. Die Analyse verschiedener Klone der doppelt transfizierten Parasiten zeigte folgende Ergebnisse. Bei einem der Klone war festzustellen, dass die episomale Kopie von PfPV1 verloren gegangen war. Dieser Klon zeigte zu dem dasselbe Muster im Southern- Blot wie die einzel transfizierten Parasiten. Dies geht konform mit der oben genannten Annahme, dass der Parasit zum Überleben auf die Expression des endogenen Gens angewiesen ist. Weitere Klone zeigten bei der Analyse, sofern sie die episomale Kopie behalten hatten, keine erfolgreiche Integration. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die erfolgreiche Expression von PfPV1 die Kontrolle des endogenen Promoters benötigt. Die während dieser Arbeit generierten Daten zeigen zum ersten Mal, dass die negative Selektionsstrategie bei Integration dazu führen kann, dass bei Plasmodium falciparum die Thymidin-Kinase kodierende Sequenz dahingehend modifiziert wird, dass sie ihre Aktivität einbüßt und Ganciclovir nicht mehr in seine toxische Form überführt. Bezüglich des GST pull down Assays gelang es nicht interagierende Proteine zu identifizieren. Möglicherweise finden Interaktionen mit PfPV1 jedoch in Entwicklungsstadien des Parasiten statt, die in dieser Arbeit nicht berücksichtigt wurden. Zusammengefasst lassen sich die Ergebnisse dieser Arbeit so interpretieren, dass PfPV1 ein einzigartiges, konserviertes Protein mit essentieller, aber noch unbekannter Funktion darstellt.