Histopathological Morphometry of Human Endobronchial Biopsies – a Comparison of Conventional Quantitative Analyses and Stereological Designs

In klinisch-therapeutischen Studien chronisch-entzündlicher Atemwegserkrankungen und in der biomedizinischen Erforschung ihrer Pathomechanismen werden fiberoptisch-bronchoskopisch entnommene endobronchiale Biopsien zunehmend häufig verwendet. Obgleich auch weniger invasive Untersuchungsmethoden der entzündlichen Veränderungen des Bronchialsystems zur Verfügung stehen, hat sich eine Standardisierung dieser alternativen Methoden bezüglich Ausmaß und Generation der untersuchten Atemwege bislang als undurchführbar erwiesen. Darüberhinaus können die strukturellen Veränderungen der Atemwegsmukosa in einem klinischen Kontext lediglich durch histopathologische Analysen von Biopsien beurteilt werden. Aus diesen Gründen erscheint die Analyse endobronchialer Biopsien für die Atemwegsforschung unabdingbar zu sein. Immer häufiger wird auch über quantitative Ansätze in Biopsiestudien berichtet. Die hohe Variabilität ihrer Ergebnisse betont die Notwendigkeit verlässlicher und robuster quantitativer Methoden und Designs der Stichprobenerhebung, um eine einfachere Interpretation und Untermauerung der Ergebnisse unterschiedlicher Studien zu ermöglichen. Es ist unklar, ob konventionelle 2D Ansätze und unverzerrte stereologische 3D Designs zum Zählen der Entzündungszellen, Messen der Flächenanteile oder der Schichtdicke auf histologischen Schnitten dafür gleich gut geeignet sind. Das Ziel dieser Arbeit war, die Übereinstimmung der 2D und 3D Zellzählansätze durch ihre gleichzeitige Anwendung zur Zählung der Entzündungszellen in bioptischem Material zu überprüfen. Darüber hinaus wurden stereologische Methoden zur Quantifizierung der Epitheldesquamation und der mittleren arithmetischen Dicke der Basalmembran vorgestellt und ihre Ergebnisse mit bereits veröffentlichten, durch 2D histologische Untersuchungen gewonnenen Daten verglichen. Die Hypothesen, dass die Epithelintegrität von dem Biopsievolumen oder der mittleren arithmetischen Dicke der Basalmembran abhängig ist, wurden ebenfalls überprüft. Biopsien aus den Segmentbronchien wurden in einer Gruppe von Rauchern (n=7) und einer Gruppe von gesunden Nichtrauchern (n=7) durch fiberoptische Bronchoskopie entnommen, anschließend in Paraffin eingebettet und erschöpfend geschnitten. Systematische, proportional geschichtete Zufallsstichproben von histologischen Schnitten wurden histochemisch (PAS) oder immunohistochemisch für Makrophagen (CD68) bzw. T-Lymphozyten (CD3) gefärbt. In denselben systematischen, proportional geschichteten Zufallsstichproben von mikroskopischen Sichtfeldern wurden die Zellzahlen per Volumeneinheit mit dem physical Disector ermittelt und die Zell- und Kernprofile gezählt und auf die Fläche der Lamina propria bezogen. Um eine nulldimensionale Größe für den direkten Vergleich der zwei Methoden zu erhalten, wurde der CD68+/CD3+ Quotient für jeden Ansatz berechnet. Das Ausmaß der Epitheldesquamation wurde als Flächenanteil der Basalmembran bewertet. Dies geschah durch das Zählen der Schnittpunkte eines Linienrasters mit der Basalmembran auf den PAS gefärbten Schnitten. Auf denselben Schnitten wurde die mittlere arithmetische Dicke der Basalmembran mittels eines kohärenten Testsystems aus Punkten und Segmenten ermittelt. Im Ergebnis überschätzte das Zählen der Zellprofile pro Flächeneinheit die Zahl der größeren Zellen (Makrophagen) relativ zu kleineren Zellen (T-Lymphozyten). Das Zählen der Kernprofile ergab ähnliche Gruppenmittelwerte zum Physical Disector, aber ein systematischer Fehler proportional zum Wert des CD68+/CD3+ Quotientes wurde identifiziert. Das Ausmaß der Epitheldesquamation war in beiden Gruppen ähnlich und stimmte mit früheren Studien mit gesunden Freiwilligen und Asthmatikern überein. Der fehlende Unterschied zwischen den (nicht-asthmatischen) Probanden dieser Studie und veröffentlichten Ergebnissen von Asthma-Patienten bestätigt vorherige ähnliche Erkenntnisse, bekräftigt den Zweifel an der pathologischen Bedeutung der Epithelabschilferung und deutet auf eine artifizielle Ursache hin. Die arithmetische mittlere Dicke der Basalmembran, eine wichtige Kenngröße des strukturellen Umbaus der Atemwege in Asthmabiopsiestudien, zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen gesunden Nichtrauchern und Rauchern. Die Mittelwerte waren den Ergebnissen eines anderen publizierten stereologischen Designs und den durch Bildanalyse von Perpendikularschnitten gemessenen Werten sehr ähnlich. Zugleich waren sie deutlich niedriger als die Werte, die von Punkt-zu-Punkt Messungen an histologischen Schnitten berichtet wurden. Dies weist auf eine Überschätzung der mittleren Dicke durch Tangentialanschnitte der Basalmembran hin, wenn diese dreidimensionale Struktur mittels 2D Ansätze quantifiziert wird.