Unusual Building Blocks and Domain Organization of Non-Ribosomal Peptide Synthetases

Die mannigfaltige Klasse der nicht-ribosomalen Peptide beinhaltet viele pharmakolisch relevante Wirkstoffe, die in der Klinik in der Antibiotika-, Krebs- und Immunsuppressions-therapie Anwendung finden. Die biologische Aktivität dieser Naturstoffe geht zurück auf deren strukturelle Vielfalt, da sie neben den proteinogenen Aminosäuren noch viele nicht-proteinoge aufweisen, von denen eine Vielzahl an der -Position modifiziert sind. Es wurde gezeigt, dass diese Modifikationen zu der beobachteten Bioaktivität beitragen, aber die biosynthetischen Ursprünge sind noch weitestgehend unerforscht. Diese Bausteine sind Schlüsselmerkmale in den Naturstoffklassen der aziden Lipopeptidantibiotka und der Kutzneride, auf die sich diese Arbeit fokussiert. Um den Mechanismus des biosynthetischen Ursprungs des synthetisch anspruchsvollen beta-Hydroxyasparagin-(hAsn)-Restes, der Teil der aziden Lipopeptide CDA und A54145 ist, aufzuklären, wurden die entsprechenden nicht-Häm Eisen(II)/alpha-Ketoglutarat-abhängigen Hydroxylasen, AsnO und LptL, rekombinant hergestellt und in vitro untersucht. Für beide Enzyme konnte gezeigt werden, dass sie die freie Aminosäure regio- und stereospezifisch hydroxylieren, was eindeutig auf einen Vorläufermolekülsynthesemechanismus hinweist. Die Kristallstruktur von AsnO konnte gelöst werden und offenbarte einen unerwarteten substratinduzierten Mechanismus. In diesem schließt sich nach Substratzugabe ein Deckel über der aktiven Tasche und schirmt sterisch anspruchsvolle Substrate ab, was weiter die beobachtete Substratspezifität für freies Asparagin erklärt. Außerdem kann die AsnO- Struktur als Prototyp für Aminosäure-modifizierende nicht-Häm Eisen Hydroxylasen dienen. Durch Vergleich der AsnO-Strukur mit 3D Modellen von homologen Enzymen war es möglich, die substratbindenden Reste in den letzteren erfolgreich vorherzusagen. Um einen umfangreichen Einblick in die Mechanismen der beta-Hydroxybausteinsynthese zu erhalten, wurden die Hydroxylasen KtzO und KtzP, welche voraussichtlich die Synthese der 3-Hydroxyglutamat-(hGlu)-Isomere, die in den Antimykotika der Kutzneride gefunden wurden, katalysieren, rekombinant produziert und in vitro untersucht. Es wurde beobachtet, dass beide Hydroxylasen in trans zum NRPS Fließband an PCP-gebundenem Glutamat arbeiten. In den Kutzneriden sind die beiden hGlu Isomere in gleichen Mengen vorhanden, daher war die Beobachtung, dass KtzO stereospezifisch threo-hGlu herstellt, wohingegen KtzP die Synthese des erythro-Isomers katalysierte, unerwartet. Desweiteren wurde eine wirkungsvolle Methode entwickelt, in der nicht-hydrolisierbare Coenzym A Derivate zum ersten Mal eine direkte Bestimmung der kinetischen Eigenschaften von Enzymen, die an PCP-gebundenen Substraten arbeiten, möglich machten. Außerdem wurde ein bisher unbekannter in trans Mechanismus einer NRPS-Fließband Wiederherstellung beobachtet. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die einzelne Adenylierungs-(A)-domäne KtzN die verkürzte und daher nicht-funktionierende A-Domäne des Kutzneridfließbandes in trans kompensiert. Zusammengefasst erläutern diese Ergebnisse den Mechanismus, auf dem die in trans Wie-derherstellung des Fließbandes und stereospezifische Hydroxyglutamatsynthese basieren. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde das gesammelte Wissen über die enzymatische beta-Hydroxylierung von Aminosäuren angewendet, um eine Methode zur Herstellung des pharmakologisch relevanten beta-Hydroxyaspartats zu entwickeln. In erster Sicht wurde dies möglich durch die Strukturaufklärung von AsnO, in der die Substrat-bindenden Reste des Enzyms identifiziert wurden. Durch gerichtete Mutagenese wurde eine AsnO Variante hergestellt, die anstelle des ursprünglichen Substrats Asparagin stereospezifisch Aspartat zu L-threo-Hydroxyaspartat umwandelt, sogar in kommerziell interessanten Mengen. Daher ist die geschaffene AsnO-Variante ein exzellentes Beispiel für die Anwendung von Grundlagenforschung für die Synthese von nicht-proteinogen Naturstoffbausteinen.