Insights into RNase P RNA structure and function by a retro-evolution approach

RNase P katalysiert die Reifung des 5’-Endes von tRNAs in allen Organismen und Organellen. Das Enzym besteht aus einer singulären RNA-Untereinheit kombiniert mit Proteinen, deren Anzahl von Bakterien (ein Protein) über Archaea (mindestens vier Proteine) zu Eukarya (neun bis zehn Proteine) hin zunimmt. Die Konserviertheit einiger Basenidentitäten deutet darauf hin, daß die RNA-Untereinheiten (P RNAs) aller drei Reiche des Lebens von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen. Dennoch ist einzig in Bakterien die RNA-Untereinheit in vitro in Abwesenheit des Proteins nennenswert aktiv, während archaeale und eukaryontische P RNAs weit mehr auf die Beteiligung ihrer Proteinuntereinheiten angewiesen sind und bei deren Fehlen lediglich äußerst geringe katalytische Aktivität zeigen. RNase P stellt daher ein natürliches Modellsystem für den Übergang von Ribozymen zu Ribonukleoproteinenzymen dar – eine Entwicklung, von der angenommen wird, dass sie allgemein im Verlauf der Evolution von der RNA-Welt hin zur Protein-Welt stattgefunden hat. Die RNA-Untereinheit der Cyanelle von Cyanophora paradoxa enthält im wesentlichen alle Strukturelemente bakterieller P RNAs, wurde aber als katalytisch inaktiv beschrieben. Im Gegensatz zu den vorangegangenen Untersuchungen konnten wir katalytische Aktivität dieser P RNA auch in Abwesenheit von Protein-Kofaktoren zeigen. Darüber hinaus bildet die P RNA von Cyanophora paradoxa mit proteobakteriellen Proteinen ein funktionelles Holoenzym. Auch Hybrid-RNAs, bei denen die C- und S-Domäne der Cyanellen-P RNA und der P RNA aus Escherichia coli untereinander ausgetauscht worden waren, waren funktionell, was deutlich macht, dass die Domänen die Fähigkeit besitzen, miteinander zu kooperieren. Die Aktivitäten dieser Chimären lagen jedoch weit hinter denen bakterieller P RNAs zurück, woraus sich schließen lässt, dass sowohl die C- als auch die S-Domäne der Cyanellen-P RNA wenig funktionell sind und somit auch die Aktivität der beiden Typen von Chimäre (EC und CE) limitieren. Zusätzlich oder alternativ könnte auch die Interaktion der Domänen oder die Faltung des Gesamtmoleküls in der Chimäre suboptimal sein, so wie es wahrscheinlich auch für die Cyanellen-Wildtyp-P RNA der Fall ist. Darüber hinaus ist das Organellen-Ribozym ungewöhnlich im Vergleich mit dem bakteriellen Konsensus: Die RNA-allein-Aktivität ist gering, und kleine Strukturveränderungen von nur einer einzigen Punktmutation oder Austausch eines Watson-Crick-Basenpaares an einer Position, die nicht Teil der universell konservierten katalytischen Kernstruktur ist, genügen ebenso, diese Aktivität komplett zu zerstören, wie der Einbau der L15-16-Schleife aus E. coli mit ihren angrenzenden Bereichen. Diese Befunde deuten darauf hin, dass die A,U-reiche Cyanellen-P RNA global optimiert, aber in ihrer Konformation instabil ist. Sie repräsentiert daher eher einen eigenen Typus von RNase P als eine degenerierte Form der bakteriellen RNase P. In diesem Zusammenhang erwies sich das E. coli P-Protein nichtsdestotrotz als universeller Aktivator der P RNA, und die Frage, ob bakterielle P Proteine mit den noch zu entdeckenden spezifischen P-Protein-Komponenten der Cyanelle von C. paradoxa verwandt sind, wird damit noch interessanter. Der höhere Proteinanteil archaealer und eukaryontischer RNase P-Holoenzyme geht mit einer erheblichen Verminderung der katalytischen Aktivität ihrer RNA-Untereinheiten (P RNAs) allein einher. Wir konnten zeigen, dass wenige Mutationen hin zum bakteriellen P RNA-Konsensus eine wesentliche Aktivierung der archaealen P RNA von M. thermoautotrophicus zur Folge haben, sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart des bakteriellen RNase P-Proteins. Für eine substanzielle Zunahme an Ribozymaktivität war der kooperative Effekt von mindestens zwei strukturellen Änderungen erforderlich. Es stellte sich heraus, daß die P1-Helix der P RNA von M. thermoautotrophicus natürlicherweise verlängert ist, was eine Zunahme der Ribozymaktivität auf etwa das zweihundertfache sowie eine Stabilisierung der Tertiärstruktur zur Folge hatte. Die Aktivitätszunahmen der mutierten archaealen C-Domänen-Varianten waren im Kontext chimärer P RNAs, also in Kombination mit der bakteriellen S-Domäne aus Escherichia coli statt der archaealen, wesentlich ausgeprägter. Dies lässt sich dadurch erklären, dass in Abwesenheit von Protein-Kofaktoren die archaeale S-Domäne ihre Fähigkeit zu fester und produktiver Bindung des Substrats verliert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das katalytische Potenzial archaealer P RNAs dem bakterieller P RNAs sehr ähnlich ist, aber durch geringe Veränderungen in der C-Domäne und, vor allem, durch eine geringe Funktionsfähigkeit der archaealen S-Domäne in Abwesenheit archaealer Protein-Kofaktoren maskiert wird. Für die eukaryontische humane RNase P RNA (H1 RNA) sowie die P RNA des niederen Eukaryonten Giardia lamblia wurde kürzlich eine katalytische Restaktivität entdeckt. Dennoch liegt die höchste für diese eukaryontischen P RNAs gemessene Aktivität mehr als fünf Größenordnungen unter der bakterieller P RNAs. Um die Struktur und Funktion der H1 RNA zu analysieren, haben wir versucht, die RNA-allein-Aktivität der H1 RNA durch die gleichen experimentellen Ansätze zu steigern, die sich bei der Aktivierung der archaealen RNase P RNA aus M. thermoautotrophicus als so erfolgreich erwiesen hatten. Es wurden einige Varianten der H1 RNA sowie HE-Chimären und H1 RNA-Substrat-Konjugate hergestellt und getestet. H1 RNA 5, die lediglich die Mutationen P4/J4/19 enthält, ist die einzige Variante mit lokal begrenzten Mutationen, die erhöhte Aktivität zeigte. Die Mutationen P4/J4/19 wurden dabei eingeführt, um eine Bakterien-ähnliche P4-Helix, mit bekannter entscheidender Bedeutung für die katalytische Aktivität, wiederherzustellen. Die zusätzlich eingefügten Mutationen hin zum bakteriellen Konsensus, P5/P15, steigerten die katalytische Aktivität noch etwas weiter – möglicherweise durch eine Stabilisierung der Kernstruktur und/oder eine Verbesserung der Substratbindung. Die Chimären-P RNA HE erwies sich als inaktiv, was darauf hinweist, dass die C-Domäne der H1 RNA nicht in der Lage ist, mit der S-Domäne von E. coli einen funktionellen Komplex zu bilden. Ein kovalentes Anhängen des Substrats an die H1 RNA, das dazu dienen sollte, die Auswirkung geringer Substrataffinitäten abzuschwächen, führte sogar zu einem Aktivitättverlust unter die Nachweisgrenze. Die kinetischen Daten zusammen mit Strukturuntersuchungen durch nicht-enzymatische Spaltung sowie UV-Schmelzkurven (nicht gezeigt) lassen vermuten, dass die H1 RNA eine extrem degenerierte, global instabile Struktur aufweist, die in ihrer Funktion strikt von den natürlichen Protein-Kofaktoren abhängig ist.