Structure-based Development of Secondary Amines as Aspartic Protease Inhibitors

Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige Leitstrukturen für die Inhibition von Aspartylproteasen, insbesondere der HIV-1-Protease, unter Verwendung strukturbiologischer Methoden entwickelt. Als Startpunkt diente die Kristallstruktur eines Komplexes der HIV-1-Protease mit einem 3,4-Dimethylenamino-pyrrolidin-Derivat. Ausgehend von der Beobachtung starker Proteinverzerrung und einer unbefriedigenden Taschenbesetzung in dieser Struktur wurden Verbindungen entwickelt, die nur die essentiellen Pharmacophor-Erfordernisse für einen HIV-Protease-Inhibitor in sich vereinen. Die symmetrischen Pyrrolidindiester-Derivate, ausgestattet mit einer zyklischen sekundären Aminofunktion zur Adressierung der katalytischen Aspartate, zwei hydrophoben Resten für die Besetzung der Erkennungstaschen und zwei Akzeptorfunktionen zur Adressierung der flexiblen Flapregion, zeigten einstellig mikromolare Inhibitionswerte. Die Kristallstrukturanalyse eines Derivates im Komplex mit der Protease offenbarte eine einzigartige Bindungssituation, in der zwei Inhibitormoleküle an ein Protease-Dimer in der geöffneten Konformation binden. Parallel zu diesem Ansatz wurden Verbindungen auf Basis eines 3S,4S-Diamino-pyrrolidin-Gerüstes entwickelt, die über vier Reste zur Adressierung der Subtaschen verfügen. Auch hier zeigten die ersten Verbindungen einstellig mikromolare Inhibition. Aus dem mittels Röntgenkristallographie aufgeklärten Bindungsmodus wurden drei Strategien zur Affinitätssteigerung postuliert und umgesetzt. Alle drei Strategien führten zu Inhibitoren mit einem deutlichen Affinitätsgewinn. Mindestens ein Vertreter jeder Strategie wurde anschließend im Komplex mit der HIV-Protease kristallisiert und analysiert. Aus den beobachteten Bindungsmodi wurden die beiden vielversprechendsten Strategien zur Kombination ausgewählt und in dem finalen Inhibitor vereint. Dieser wies mit 74 nM eine weitere deutliche Affinitätssteigerung auf, und die Analyse der Kokristallstruktur bestätigte den methodischen Ansatz. Mit den deutlich affineren Substanzen wurden kinetische Untersuchungen an zwei ausgewählten, klinisch relevanten Punktmutanten der HIV-Protease durchgeführt. Während ein Affinitätsverlust im Falle der Ile50Val-Mutation zu beobachten ist, zeigen die Verbindungen eine erhebliche Affinitätssteigerung im Falle der Ile84Val-Mutation. Zwei Verbindungen, bei denen dieses Phänomen besonders zu Tage tritt, wurden anschließend im Komplex mit den Protease-Varianten strukturell untersucht. Aus der Analyse ergab sich, dass im Falle der Ile84Val Mutation eine Kombination aus mehreren Faktoren zur beobachteten Affinitätssteigerung beiträgt. Besonders die Beobachtung veränderter physikochemischer Eigenschaften in der Kontaktregion zur Aminosäure 84 ist hierbei von erheblicher Relevanz für die Entwicklung zukünftiger Generationen von HIV-Protease-Inhibitoren, mit einer wahrscheinlich deutlich geringeren Empfindlichkeit gegen diese Mutation. Aus den kinetischen Studien ergab sich zudem, dass Verbindungen mit kleineren Alkylresten ein deutlich verändertes Aktivitätsprofil gegenüber den Mutanten aufweisen. Bei dem Versuch, diese Beobachtung strukturell zu untersuchen, wurden Kokristalle eines in der Zusammensetzung identischen Protein-Ligand Komplexes in zwei verschieden Raumgruppen erhalten. In der orthorhombischen Kristallform ist ein Bindungsmodus vergleichbar zu den vorher untersuchten Verbindungen zu beobachten, wohingegen in der hexagonalen Kristallform ein Bindungsmodus zu beobachten ist, der sich fundamental von diesem unterscheidet. Eine uneinheitliche Struktur-Aktivitäts-Beziehung in Bezug auf die Protease-Varianten legt ein paralleles Vorliegen dieser beiden Bindungsmodi nahe. Anhand der in den Projekten gesammelten Erfahrungen wurde ein genereller Ansatz für die Leitstrukturfindung für Aspartylprotease-Inhibitoren auf der Basis eines Oligoamin-Grundgerüstes entwickelt und umgesetzt. Eine 11 Verbindungen umfassende Bibliothek wurde gegen sechs ausgewählte Proteasen (HIV-1 Protease, Plasmepsin II, Plasmepsin IV, Renin, BACE-1 und Pepsin) getestet und es konnten eine Vielzahl von mikromolare Inhibitoren identifiziert werden. Mit der Hilfe der Kokristallstrukturen zweier Derivate im Komplex mit der HIV-Protease konnte eine generelle Bindungssituation für die untersuchten Aspartylproteasen postuliert und mit Affinitätsdaten bestärkt werden. In dieser Arbeit wurden vielfältige Ansätze für die Entwicklung sekundärer Amine als Aspartylprotease-Inhibitoren erarbeitet. Besonders hervorzuheben ist die Entwicklung von Verbindungen, die an die geöffnete Konformation der HIV-Protease binden und somit die Entwicklung einer neuen Klasse von Inhibitoren ermöglichen. Zudem ist es gelungen, eine neue, potente Klasse von Inhibitoren zu etablieren, die im Vergleich zu den literaturbekannten Inhibitoren über einzigartige Eigenschaften gegenüber der Ile84Val Punktmutation verfügt.