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Identifizierung von Inhibitoren der Wachstumsarrest induzierenden Funktion von Miz1 und Charakterisierung von 14.3.3eta als Inhibitor der Funktion von Miz1
Der mit Myc interagierende Transkriptionsfaktor Miz1 wird für die transkriptionelle Aktivierung der Cdk-Inhibitoren p15Ink4b und p21Cip1 benötigt. Durch die Aktivierung dieser Gene induziert Miz1 in Zellen einen Wachstumsarrest in der G1-Phase des Zellzyklus. Myc i...
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| Main Author: | |
|---|---|
| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2008
|
| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Der mit Myc interagierende
Transkriptionsfaktor Miz1 wird für die transkriptionelle
Aktivierung der Cdk-Inhibitoren p15Ink4b und p21Cip1
benötigt. Durch die Aktivierung dieser Gene induziert Miz1 in
Zellen einen Wachstumsarrest in der G1-Phase des Zellzyklus.
Myc inhibiert die Miz1-abhängige Induktion des G1-Arrestes
durch Ausbildung eines Komplexes mit Miz1, wodurch Myc die
Transaktivierungsaktivität von Miz1 hemmt. In der
vorliegenden Arbeit wird ein retrovirales Screen-Verfahren
beschrieben, daß mit dem Ziel durchgeführt wurde neue Gene
zu identifizieren und charakterisieren, die für Inhibitoren
der wachstumshemmenden Funktion von Miz1 kodieren. Dazu wurde
eine humane cDNA-Expressionsbibliothek retroviral in Rat1-
Fibroblastenzellen infiziert, die zusätzlich mit Miz1
exprimierenden Retroviren superinfiziert wurden. Der
eingesetzte Titer der Miz1 exprimierenden Retroviren, führte
zu einem vollständigen Wachstumsarrest in parentalen
Rat1-Fibroblasten. Die Identität der cDNA-Insertionen der
erhaltenen Zellklone wurde mittels PCR-Technik und
Sequenzierung ermittelt. Es wurde insgesamt siebenmal eine
für c-Myc kodierende cDNA und zweimal eine für ein Fragment
des gamma Actin kodierende cDNA isoliert. Es konnte in allen
analysierten Zellklonen eine bestehende ektopische Expression
von Miz1 nachgewiesen werden. Die Isolierung vollständiger
Gensequenzen mit einer Inhibitionsfunktion demonstrieren, daß
das durchgeführte Screen-Verfahren technisch gut
funktioniert hat. Jedoch führte die Ermittlung der cDNAs als
humane c-Myc Sequenzen als Inhibitor des Miz1 induzierten
Wachstumsarrestes nicht zu neuen Erkenntnissen, da diese
Interaktion bereits bekannt und untersucht war (Peukert et
al., 1997). Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit
der Charakterisierung von 14.3.3eta, als Inhibitor der
Funktion von Miz1. Dabei handelt es sich um eine Isoform der
14.3.3 Proteinfamilie, die in Säugern insgesamt neun
Mitglieder umfaßt. 14-3-3eta wurde als potentieller Kandidat
in einem anderen retroviralen Screen-Verfahren gefunden, das
ebenfalls zur Identifizierung neuer Inhibitoren der
wachstumshemmenden Funktion von Miz1 durchgeführt wurde.
Dazu wurde eine retrovirale cDNA-Expressionsbibliothek
eingesetzt, um gezielt nach Inhibitoren zu suchen, die das
langsame Wachstum von Zusammenfassung 124 Miz-1
überexprimierenden Rat1-Fibroblastenzellen überwinden
können. Die Überexpression von 14-3-3eta hemmt den
Miz1-induzierten Wachstumsarrest in der G1-Phase des
Zellzyklus durch Inhibition der Miz1-abhängigen
Genaktivierung der der Cdk-Inhibitoren p15INK4B und p21CIP1,
ähnlich wie Myc und TopBP1. Darüber hinaus antagonisiert
14.3.3eta auch die Apoptose in Rat1-Fibroblsaten, die durch
eine Überexpression von Miz1 induziert wird. Es konnten in
der Sequenz von Miz1 zwei potentielle Bindemotive für die
Bindung von 14.3.3 Proteinen, sogenannte Mode I Motive,
ermittelt werden, die in der Nähe und innerhalb der
DNA-bindenden Domäne liegen. In dem ersten Motiv befindet
sich an Position 291 ein phosphorylierbares Threonin und im
zweiten Motiv an Position 428 ein phosphorylierbares Serin.
14-3-3eta bindet über diese beiden Motive direkt an Miz1.
Punktmutanten von Miz1, die nicht mehr an 14-3-3eta binden
können, demonstrieren, daß die Hemmung der Miz1-abhängigen
Genaktivierung von p21Cip1 und p15Ink4b durch 14-3-3eta von
den beiden Erkennungsmotiven abhängt. Dabei ist die Hemmung
von der Phosphorylierung der Aminosäuren Threonin291 und
Serin428 abhängig. Mechanistisch erfolgt die Hemmung von
Miz1, indem 14-3-3eta die Bindung von Miz1 an die Initiator
Elemente der Zielgen-Promotoren verhindert. Die zelluläre
Lokalisation von Miz1 wird durch die Interaktion mit
14-3-3eta nicht verhindert. Die Vorraussetzung der
Interaktion von 14-3-3eta mit seinen Liganden ist die
Phosphorylierung der Serin/ Threonin Reste in den
Erkennungsmotiven. Die Phosphorylierung des Serin428 in Miz1
erfolgt durch die Akt/ PKB Kinase und ist notwendig für die
Interaktion von 14-3-3eta und Miz1 und die daraus
resultierende Inhibition der Funktion von Miz1.
Genexpressionsanalysen zeigten, daß Miz1 zwei veschiedene
Funktionen in der Regulation der Genexpression besitzt. Zum
einen ist Miz1 für die nach DNASchädigung erfolgende
Aktivierung einer großen Gruppe von Genen notwendig. Diese
Funktion wird durch Myc, aber nicht durch Akt/ 14-3-3eta
reguliert. Zum anderen reprimiert Miz1 eine Gruppe von Genen
nach Schädigung der DNA. Diese reprimierende Funktion wird
durch Akt/ 14-3-3eta aber nicht durch Myc reguliert. Die
Akt-abhängige Phosphorylierung von Miz1 und die darauf
folgende Bindung von 14-3-3eta scheint in der Regulation des
Zellzyklusarrestes während der DNA-Schadensantwort eine
wichtige Rolle zu spielen. |
|---|---|
| Physical Description: | 154 Pages |
| DOI: | 10.17192/z2009.0040 |