Non-Viral Gene Delivery Systems: Studies on HER2-Targeted PEG-PEI Copolymers and Modified Chitosans

Die vorliegenden Arbeit befasst sich mit der Synthese und Charakterisierung neuer nicht-viraler Genvektoren. Im ersten Teil werden verschiedene Fragestellungen hinsichtlich des Gentransfers mittels zielgerichteter Polyethylenglykol (PEG)-modifizierter Polyethylenimine behandelt. Der zweite Teil beschäftigt sich mit Chitosan und Chitosanderivaten und deren Eignung zum Gentransfer. Zunächst wurden basierend auf PEI, PEG und dem HER2 spezifischen monoklonalen Antikörper Trastuzumab verschiedene Konjugate hergestellt, wobei sowohl die verwendeten PEG-PEI Kopolymere als auch die Linker variiert wurden. Die DNA-Komplexe der hergestellten Konjugate wurden dann hinsichtlich ihrer hydrodynamischen Durchmesser und Zetapotentiale untersucht. Alle Konjugatkomplexe zeigten Größen, die für eine endozytotische Aufnahme geeignet waren. Weiterhin zeigten alle Polyplexe neutrale Komplexoberflächen, sodass die unspezifische Bindung an nicht-Zielzellen deutlich vermindert war. In der Zellkultur wurden die verschiedenen Polyplexe hinsichtlich ihrer Bindungs- und Aufnahmeeffizienz in HER2 überexprimierende Zellen untersucht. Hierbei wurden signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Konjugaten festgestellt, welche sich auch in den Transfektionseffizienzen wieder spiegelten. Die vielversprechendsten Ergebnisse wurden mit einem Konjugat erhalten, bei dem Trastuzumab mittels eines kurzen PEG-Linkers and PEI gekoppelt wurde. Die hergestellten Konjugate wurden weiterhin hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit in vivo untersucht. Die Blutkompatibilität wurde durch Inkubation der Polyplexe mit isolierten Erythrozyten und nachfolgender Bestimmung der Hämolyse und der Erythrozytenmorphologie untersucht. Sowohl die hämolytische Aktivität als auch der Einfluss auf die Erythrozytenmorphologie war bei allen Konjugatkomplexen äußerst gering. Untersuchungen zur Pharmakokinetik und Organverteilung ergaben eine gegenüber PEI und DNA signifikant erhöhte AUC und eine signifikant verminderte Deposition in der Lunge und Milz. Weiterhin wurde ein HER2 überexprimierendes Tumormodell in SCID-Mäusen etabliert, um in Zukunft weitere in vivo Untersuchungen solcher Konjugate zu ermöglichen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Chitosan, Trimethyl Chitosan bzw. Polyethylenglykol-graft-Trimethyl Chitosan/pDNA Komplexe hinsichtlich ihrer physikochemischen Eigenschaften charakterisiert. Weiterhin wurde die Zytotoxizität sowie die Aufnahme- und Transfektionseffizienz in der Zellkultur untersucht. In diesen Untersuchungen zeigte Chitosan zwar einerseits sehr niedrige Zytotoxizitäten, andererseits bildeten sich aber unter physiologischen Bedingungen große Aggregate und die zelluläre Aufnahme betrug lediglich 7%. Die Quarternisierung von Chitosan erhöhte die Löslichkeit, die DNA Kondensierung und die Komplexbildung bei physiologischem pH. Die zelluläre Aufnahme war 8.5-fach gegenüber Chitosan-Komplexen erhöht, die Transfektionseffizienz stieg um das 678-fache. Die PEGylierung von Trimethyl Chitosan führte nicht nur zu einer Verringerung der Zytotoxizität und zu einer weiter erhöhten Löslichkeit sondern erhöhte auch die kolloidale Stabilität der Polyplexe. Dies führte zu einer bis zu 10-fach erhöhten Transfektionseffizienz gegenüber Trimethyl Chitosan in verschiedenen Zelllinien. Die zellulären Aufnahmewege und die intrazelluläre Prozessierung der Komplexe wurde in zwei Zelllinien untersucht. In L929 Zellen wurden die Komplexe hauptsächlich durch Clathrin-vermittelte Endozytose aufgenommen, die im Fall von TMC und PEG-TMC von Aufnahme über Caveolae begleitet wurde. Die Transfektionseffizienz wurde wesentlich durch Inhibierung der Clathrin-vermittelten Endozytose beeinflusst. In A549 Zellen wurde die Komplexe ebenfalls im wesentlichen durch Clathrin-vermittelte Endozytose aufgenommen, die in diesem Fall von Macropinozytose begleitet wurde. Die Transfektionseffizienz wurde wiederum wesentlich von Clathrin-vermittelter Endozytose beeinflusst. In dieser Studie wurde festgestellt, dass neben der zellulären Aufnahme weitere Schritte, v.a. der intrazellulären Prozessierung der Komplexe, von mindestens ebenso großer Bedeutung für die Transfektionseffizienz sind.