Enzymes of two clostridial amino-acid fermentation pathways

Zwei Enzyme der Alanin-Fermentation von Clostridium propionicum wurden aufgereinigt und biochemisch untersucht. Das Enzym (R)-Lactyl-CoA Dehydratase, das eine chemisch schwierige Wasserabspaltung von (R)-Lactyl-CoA zum Acrylyl-CoA katalysiert, konnte unter strikt anaeroben Bedingungen partiell aufgereinigt werden. Grüne Fraktionen der Komponente D und dunkle braune Fraktionen der Komponente A (Aktivator) wurden erhalten. Über MALDI Massenspektrometrie konnte Lactyl-CoA (m/z = 840), das Hydratysierungsprodukt von Acrylyl-CoA nachgewiesen werden. Dazu wurde Acrylyl-CoA, Komponente D und Komponente A in Anwesenheit von ATP, Mg2+ und Dithionit inkubiert. Ein zweites Enzym der Alanin-Fermentation, das die Addition con Ammoniak an Acrylyl-CoA katalysiert, wurde identifiziert. Die spezifische Aktivität der beta-Alanyl-CoA-Ammonia-Lyase ist im Extrakt von Zellen, die auf -Alanin gewachsen waren, 143 U mg-1 während auf D,L-Alanin gewachsene Zellen nur 0,44 U mg-1 enthielten. Daher konnte das Enzym über eine einzige Source 15-Q Säule aus -Alanin gewachsenen Zellen leicht gereinigt werden. Das Enzym hat eine native molekulare Masse von 95 kDa und ist aus sechs 16 kDa Untereinheiten zusammengesetzt (alpha6). Es zeigt eine hohe spezifische Aktivität für Acrylyl-CoA (Km = 23 µM; Vmax 1000 U mg-1) unabhängig von der Ammoniak-Konzentration (Km = 70 mM) Das hohe kcat/Km = 107 M-1 s-1 zeigt, dass die Reaktion beinahe diffusionslimitiert ist. Die Abspaltung von Ammoniak in der Rückreaktion (beta-alanyl-CoA Km = 210 µM) in wird in Anwesenheit von 100 mM NH4Cl bei gleichem beta-alanyl-CoA Km Wert zu 70 % gehemmt. Das Enzym, das die Reduktion von Crotonyl-CoA zum Butyryl-CoA in der Glutamat Fermentation von Clostridium tetanomorphum über 3-Methylaspartat katalysiert, wurde zusammen mit einen „Electron transfer flavoprotein“ (ETF) aufgereinigt. Der Komplex Butyryl-CoA-Dehydrogenase-ETF, ist ein alpha,beta,gamma-Heteromer (m = 360 kDa), das aus drei unterschiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist: die 40 kDa alpha-Untereinheit (Butyryl-CoA-Dehydrogenase), die 36 kDa beta-Untereinheit (ETF alpha-Untereinheit) und die 28 kDa gamma-Untereinheit (ETF beta-Untereinheit). Das Enzym enthält weniger als 1 mol FAD, aber es nimmt bis zu 2 zusätzliche FAD Moleküle auf. Der gereinigte Enzym-Komplex zeigt Butyryl-CoA-Dehydrogenase Aktivität (1 U mg-1) mit Ferricenium als Elektronenakzeptor und Diaphorase Aktivität unter aeroben und anaeroben Bedingungen. Wenn 50 µM FAD im Test zugesetzt worden war, konnte mit NADH bei einer gleichzeitigen geringen Diaphorase-Aktivität (1 U mg-1) Crotonyl-CoA-Reduktase Aktivität bei 340 nm anaerob nachwiesen werden (20 U mg -1). Mit Immuno-goldlabelling-Elektronmikroskopie war der Komplex hauptsächlich im Zytoplasma des Bakteriums lokalisiert worden. Das Ergebnis ist mit einer direkten Beteiligung der exergonen Crotonyl-CoA-Reduktion an der Energiekonservierung über eine elektrochemischen Protonengradienten unvereinbar. Darüber hinaus ebnete es den Weg zu der Entdeckung einer dritten Art der Energiekonservierung.