Macrocyclization and Fatty Acid Modification during the Synthesis of Nonribosomal Peptides
Nonribosomal peptides (NRPs) constitute a large and diverse class of pharmacologically important natural products that find useful therapeutic application as immunosuppressants, antibiotics, or anticancer agents. The biological activity of many of these compounds relies on the macrocyclic structure...
Main Author: | |
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Contributors: | |
Format: | Doctoral Thesis |
Language: | English |
Published: |
Philipps-Universität Marburg
2008
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Subjects: | |
Online Access: | PDF Full Text |
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Nichtribosomale Peptide (NRPs) bilden eine große und vielseitige Klasse von pharmakolo¬gisch bedeutsamen Naturstoffen, die als Immuno¬supressiva, Antibiotika oder Antikrebs-Wirkstoffe nützliche therapeutische Anwendung finden. Die biologische Aktivität vieler dieser Verbindungen beruht auf der makrozyklischen Struktur ihres Peptidrückgrats und der Inkorporierung eines großen Sortiments an Bausteinen, das proteinogene und nicht¬proteinogene Aminosäuren sowie modifizierte Fettsäurereste umfasst. Diese strukturellen Merkmale sind Schlüsseleigenschaften nichtribosomaler Lipopeptid¬antibiotika, die im Fokus dieser Arbeit stehen. Um einen Zugang zu den strukturell anspruchsvollen Lipopeptiden Daptomycin und A54145 zu schaffen, wurde ein chemoenzymatischer Ansatz entwickelt, der auf dem kombinierten Einsatz von leistungsstarker Peptid-Festphasensynthese und rekombinanten Thioesterase Domänen basiert. In vitro Studien mit diesen so genannten Peptidzyklasen zeigten deren Fähigkeit, lineare Peptidyl-Thiophenol-Substrate mit entspannter Substratspezifität zu zyklisieren. Zehn Lipopeptidanaloga wurden hergestellt, um die relativ unbekannte Struktur-Aktivitäts Beziehung der aziden Lipopeptide zu erforschen. Bemerkenswerterweise enthielt diese kleine Bibliothek einen Lipopeptidhybrid mit einer minimalen Inhibitionskonzentration ähnlich der von chemoenzymatisch hergestelltem Daptomycin, sowie eine bioaktive A54145 Makrolactamvariante. Somit konnten einzelne Aminosäurereste in der Daptomycin- und A54145-Peptidsequenz identifiziert werden, die essentiell für deren antimikrobielle Eigenschaften sind. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit eine bisher unbekannte Form der Iminmakrozyklisierung, wie sie für das cyanobakterielle Nostocyclopeptid (ncp) auftritt, untersucht. Experimente mit ncp-CoA-Substratmimikry zeigten, dass eine außerge¬wöhnliche Reduktase (R) Domäne, die sich am C-terminalen Ende der ncp nicht¬ribosomalen Peptidsynthetase (NRPS) befindet, für die reduktive Freisetzung eines reaktiven Peptidaldehyds verantwortlich ist. Anschließend verläuft die Iminmakro¬zyklisierung enzymunabhängig unter physiologischen pH Bedingungen, was durch synthetische ncp-Aldehyde belegt werden konnte. Ein Alanin-Scan Experiment identifizierte einzelne strukturelle Elemente im linearen Heptapeptidvorläufer, die ent-scheidend für den intramolekularen Zyklisierungsprozess sind. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die CDA Tailoring Enzyme HxcO und HcmO des trans 2,3 Epoxyhexansäure Biosynthesewegs als Modellsystem gewählt, um die Fettsäuremodifikation in der Synthese nichtribosomaler Lipopeptide zu untersuchen. Während HxcO als ein neuer Enzymtyp mit dualer Funktion als FAD-abhängige Fettsäure Oxidase mit intrinsischer Epoxidaseaktivität charakterisiert wurde, konnte HcmO als eine zweite Epoxidase identifiziert werden, die an 2,3-ungesättigen Fettsäuren arbeitet. Experimente mit Acyl-CoAs, Acy-CoA beladenem Acyl Carrier Protein (ACP) sowie chemoenzymatisch hergestellten CDA Varianten ergaben, dass beide Enzyme nur ACP gebundene Substrate akzeptieren. Um diese ACP gebundenen Reaktionsprodukte mit synthetischen Standards vergleichen zu können, musste ein neuer experimenteller Ansatz entwickelt werden. Aufgrund der thermodynamischen Aktivierung von Thioesterderivaten, wurden die Enzymprodukte über eine Amidligationsreaktion unter milden Bedingungen vom ACP abgespalten und direkt in kleinere Derivate überführt, die für die HPLC MS-Analyse geeignet sind. Es wurde ermittelt, dass die trans 2,3 Epoxyhexansäure-Produkte von HxcO und HcmO entgegensetzte absolute Konfiguration, nämlich (2R,3S) bzw. (2S,3R), besitzen. Der etablierte experimentelle Ansatz birgt ein hohes Potenzial für die Analyse aller biochemischen Systeme, die an Carrier Protein-gebundenen Intermediaten arbeiten, wie z.B. integrierte Enzyme aus NRPSs und Polyketidsynthasen (PKSs) oder andere in trans agierende Tailoring Enzyme.