Functional and biochemical analysis of acidic amino acid transport and utilization by Pseudomonas putida KT2440

Das Gram-negative Bodenbakterium Pseudomonas putida ist in der Lage, eine ungewöhnlich große Zahl organischer Verbindungen als Quelle für Energie und Biomasse zu nutzen. Unter diesen Verbindungen sind auch die sauren Aminosäuren Glutamat (Glu) und Aspartat (Asp) sowie deren Amide Glutamin (Gln) und Asparagin (Asn). Wächst P. putida auf einer dieser Verbindungen, wird eine Gruppe von Genen induziert, die für Aufnahme und Verwertung dieser Aminosäuren notwendig sind. Aus früheren Untersuchungen war bereits bekannt, dass das Zweikom¬¬po¬nentensystem AauRS an diesem Anpassungsprozess beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir am Beispiel des Stammes P. putida KT2440 die Rolle des Aau-Systems bei der Aufnahme und Verstoffwechslung der sauren Aminosäuren im Einzelnen. Aau-negative Mutanten waren unfähig, auf Glu and Gln als einziger C- und N-Quelle zu wachsen und zeigten auch massive Defekte in der Aufnahme von Glu und Asp. Außerdem waren sie nicht mehr in der Lage, periplasmatische Glutaminase/Asparaginase (PGA) zu exprimieren, ein Enzym das die die Hydrolyse von Gln und Asn zu den betreffenden Dicarboxylaten katalysiert. Auch andere Enzyme des Glu- und Asp-Stoffwechsel waren in ihrer Aktivität verändert. Mutanten mit inaktiviertem AauR akkumulierten beim Wachstums auf Asn und Asp intrazellulär große Mengen von Glutamat. Die dabei auftretenden Glutamatspiegel waren um ein Vielfaches höher als in Wildtyp-Zellen. Diese Exkretion von Glutamat, die auch bei Citratzyklus-Mutanten anderer Rhizobakterien beobachtet wurde, wird wahrschein¬lich durch den bidrektionalen ABC-Transporter Bra bewirkt. Die Anhäufung von Glutamat geht vermutlich auf die in AauR-Mutanten erhöhten Aspartase-Aktivitäten zurück. Dieses Enzym kanalisiert das Kohlenstoffskelett von Asp in den Citratzyklus, von wo aus durch die Glutamatdehydrogenase Glutamat gebildet werden kann. Im Genom von P. putida KT2440 liegt direkt neben aau ein weiteres Operon, das von den Genen PP1068-PP1071 gebildet wird und für einen ABC-Transporter kodiert. Wir haben diesen Transporter Aat benannt (für acidic amino acid transporter). Aat wird hochreguliert, wenn P. putida auf sauren Aminosäuren oder deren Amiden wächst. Das AatPMQJ-System ist ein Transporter für polare Aminosäuren und gehört zur Gruppe 3 der Familie der periplasmatischen Ligandenbindungsproteine (SBP_Bac_3). Der Aat-Transporter besteht aus vier Untereinheiten, dem Nucleotid bindenden Protein AatP, zwei die Membran durchspannenden Permease-Einheiten (AatM und Aat Q) sowie dem periplasmatischen Bindeprotein AatJ. Rekombinant exprimiertes und gereinigtes AatJ zeigte hohe Affinität zu Glu und Asp (Kd = 0.4 μM bzw. 1.3 μM), während Gln und Asn und andere Dicarboxylate mit viel geringerer Affinität gebunden werden. Eine (auf Grundlge des Glutamin bindenden Proteins GlnH von E. coli) durch Homologie¬modelling erzeugte AatJ-Struktur legte nahe, dass sich sein Ligandenbindungszentrum von dem anderer Bindeproteine unterscheidet, wobei mehrere Argininreste maßgeblich sind. Die modellierte Struktur wurde experimentell bestätigt, indem diverse Aminosäurereste, die nach dem Modell an Wechselwirkungen mit dem Liganden beteiligt sein sollten, durch gerichtete Mutagenese verändert wurden. Eine Suche in Sequenzdatenbanken zeigte, dass AatJ zusammen mit mindestens 15 weiteren Proteinen eine neue Subfamilie der periplasmatischen Bindeproteine bildet. Die Beteiligung des Zweikomponentensystems AauRS an der Regulation der Transkription von aat und ansB (dem für PGA kodierenden Gen) wurde mit Hilfe des EMSA (electrophoretic mobility shift assay) nachge¬wiesen. Dabei zeigte sich, dass gereinigtes AauR an beide Promotoren bindet. Die genaue Bindungsstelle wurde durch DNAaseI-„Footprints“ identifiziert. Sie besteht in einem hoch konservierten Inverted Repeat aus je 6 bp, die durch 4 bp getrennt sind (GTTCGGNNNNCCGAAC). Bei einer in-silico Suche im P. putida KT2440-Genom wurden zusätzliche Gene entdeckt, die ebenfalls das AauR-Bindemotiv in ihrer Promoterregion enthalten. Zu den Produkten dieser Gene gehören ein H+/Glu-Symporter (GltP), das Enzym Phosphoenolpyruvat-Synthase (PpsA), ein ABC-Transporter für verzweigtkettige Aminosäuren (Bra) and das Disulfidaustauschprotein DsbC. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse war es erstmals möglich, am Beispiel P. putida KT2440 konkrete Vorstellungen zur Aufnahme und Metabolisierung der sauren Aminosäuren und ihrer Regulation durch das AauRS Zweikom¬ponen¬tensystem zu entwickeln.