Structure-function relationships, tertiary interactions and thermostability of RNase P

Identifizierung von rnpB und rnpA in den Aquificales Da die Aquificales (die nächsten Verwandten von Aquifex aeolicus) eine Gruppe von Bakterien darstellen, für die wenig über RNase P bekannt ist, wollten wir untersuchen, ob auch andere Mitglieder dieses Subphylums außer Aquifex aeolicus Besonderheiten hinsichtlich dieses essentiellen Enzyms aufweisen. In Zusammenarbeit mit einer Bioinformatik-Forschungsgruppe (Gerhard Steger, Düsseldorf) identifizierten wir die Gene für die P RNAs (rnpB) und P Proteine (rnpA) der beiden Aquificales Sulfurihydrogenibium azorense und Persephonella marina. Ihre P RNAs entsprechen dem bakteriellen P RNA-Konsensus, erwiesen sich bei hohen Metallionenkonzentrationen als aktive Katalysatoren und konnten unter Niedrigsalzbedingungen durch heterologe bakterielle P Proteine aktiviert werden. Beiden P RNAs fehlt die Helix P18 und damit eine der drei Tetraloop-Helix-Interaktionen, die die S- und die C-Domäne miteinander verbrücken. Die P RNAs von S. azorense und P. marina sind thermostabiler als die P RNA von E. coli und bedürfen zur korrekten Faltung höherer Temperaturen. Die Gene für die P Proteine (rnpA) von S. azorense und P. marina wurden ebenfalls identifiziert und sind, wie in den meisten Bakterien, im Genom mit dem rpmH-Gen, codierend für das ribosomale Protein L34, co-lokalisiert. Weiterhin identifizierten wir RNase P-Aktivität auch in anderen Aquificales (Aquifex pyrophilus, Hydrogenobacter thermophilus TK 6 und Thermocrinis ruber) und zeigten, daß durch Zugabe von P Protein von E. coli oder B. subtilis aus der Total-RNA dieser Aquificales aktive RNase P-Holoenzyme rekonstituiert werden können. Darüber hinaus konnten wir zeigen, daß einem nahen Verwandten von A. aeolicus, A. pyrophilus, das rnpA-Gen im kanonischen Kontext ebenfalls fehlt. Schließlich gelang es uns, RNase P-Aktivität in Fraktionen von A. aeolicus-Zelllysaten zu detektieren und zu zeigen, dass hier das Enzym eine essenzielle Proteinkomponente besitzt, die, anders als bei anderen bakteriellen RNase P-Enzymen, nicht durch E. coli- oder B. subtilis- RNase P Proteine ersetzbar ist. Strukturelle Grundlagen von Ribozym-Stabilität: die P1-L9-Interdomäneninteraktion in RNase P-RNA Die beiden unabhängigen Faltungsdomänen von bakteriellen Typ A-RNase P RNAs sind durch drei weitreichende Tertiärinteraktionen miteinander verbunden: P1-L9, L8-P4 und P8-L18. Obwohl sich diese durch phylogenetische Analysen vorhersagen und durch Röntgenkristallographie bestätigen ließen, ist die genaue strukturelle und funktionelle Bedeutung dieser Interaktionen weitgehend unklar. Unsere Analyse der P RNAs der thermophilen Aquificales S. azorense und P. marina (s. o.) zeigte, daß diese P RNAs, wie auch die des thermophilen Bakteriums Thermus thermophilus, in einem 5’-GYAA L9-Tetraloop sowie einer P1-Rezeptor, bestehend aus einem Tandem-GC-Basenpaar, übereinstimmen – eine Kombination, die man in anderen Bakterien so nicht findet. Darüber hinaus wurde beobachtet, daß Helices P1 und P9 in P RNAs von thermophilen Bakterien durch Helix-Verlängerungen und/oder Deletion von ungepaarten Nukleotiden („Bulges“) stabilisiert werden. Diese Beobachtungen veranlassten uns, die Bedeutung der P1-L9-Interaktion in P RNAs des thermophilen Bakteriums Thermus thermophilus zu untersuchen und mit der in dem mesophilen Bakterium E. coli zu vergleichen. Der P1-L9-Kontakt erwies sich tatsächlich als von fundamentaler Bedeutung für die Faltung und Aktivität der T. thermophilus-RNase P RNA bei hohen Temperaturen sowie bei den niedrigen Magnesiumionenkonzentrationen der Holoenzym-Reaktion. Durch native PAGE zeigte ich, daß die P1-L9-Interaktion ein wesentlicher Ankerpunkt für die Faltung in das aktivste RNA-Konformer der T. thermophilus-RNase P RNA ist. Im Gegensatz dazu bewirkte die Störung dieser Interaktion im mesophilen Bakterium E. coli weder eine Beeinträchtigung der Funktion in vivo noch in vitro. Dagegen führte der Austausch des P1-L9-Moduls von E. coli RNase P RNA gegen das aus T. thermophilus zu einer thermostabilen E. coli-P RNA-Variante. Ich ersetzte das P1-L9-Interaktionsmodul der E. coli-P RNA außerdem durch eine alternative Pseudoknoten-Struktur, die in manchen Mycoplasma-P RNAs an korrepondierender Stelle zu finden ist, was ebenfalls zu einer Thermostabilisierung der chimären P RNA führte. Diese Arbeit zeigt zum ersten Mal, daß das P1-L9-Modul direkt mit der Thermostabilität von P RNAs in Zusammenhang steht – ein Befund, der einen wichtigen Schritt für das Verständnis der Beziehung von Struktur und Funktion katalytischer RNAs darstellt.