Modes of action of cryptochrome 2 from Arabidopsis thaliana

Cryptochrome sind mit DNA-Photolyasen eng verwandte UV-A/Blaulicht-Photorezeptoren, die zahlreiche Entwicklungsprozesse in Pflanzen steuern. Arabidopsis thaliana Cryptochrom 2 (cry2) spielt hierbei eine zentrale Rolle bei der photoperiodischen Regulation der Blühinduktion. Obwohl die biologischen Funktionen von Cryptochromen in Pflanzen gut untersucht sind, sind deren photochemischen Prozesse, die zur Aktivierung führen, wenig verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche Aspekte der Aktivierung von cry2 untersucht. Zahlreiche pflanzlichen Photorezeptoren und Komponenten der Lichtsignaltransduktion dimerisieren. Entsprechend wurde hier untersucht, ob dies auch für cry2 der Fall ist. Immunpräzipitationsstudien an Proteinextrakten transgener Arabidopsis Pflanzen, die cry2-GFP exprimieren, zeigten, dass cry2 in vivo als Dimer vorliegt. Licht scheint keinen Einfluss auf die Dimerisierung zu haben. Bei der Analyse, welche Domänen von cry2 für Dimerisierung notwendig sind, konnten keine eindeutigen Befunde erzielt werden, da sowohl die N-terminale Domäne (CNT2) als auch die C-terminale Domäne (CCT2) als Monomer gefunden wurden. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit von cry2 mit cry1 wurde untersucht, ob diese Heterodimere bilden. Die vorliegenden Befunde gaben darauf keinen Hinweis. Um die Rolle der Dimerisierung von cry2 auf dessen biologische Funktion zu untersuchen, wurden transgene Linien untersucht, die neben dem endogenen cry2 zusätzlich CCT2-GFP oder cry2-GFP exprimieren. Cry2-GFP Dimere wurden lichtabhängig phosphoryliert und abgebaut, ähnlich dem endogenen cry2. Im Gegensatz hierzu, blieben die CCT2-GFP Monomere unphosphoryliert und stabil. Weiterhin führte die Expression von cry2-GFP zu einer Beschleunigung des Blühens unter Kurztag-Bedingungen im Vergleich zum Wildtyp, nicht aber die Expression von CCT2-GFP. Pflanzliche Cryptochrome, die in E. coli exprimiert wurden, tragen zwei Chromophore (FAD und MTHF). Nach Expression in eukaryontischen Systemen wie Insektenzellen konnte bislang allerdings keine Bindung von MTHF an cry nachgewiesen werden. Kenntnisse darüber, welche Chromophore an cry in planta gebunden sind, sind für die Interpretation der spektroskopischen Daten dieser Photorezeptoren bedeutsam. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit Epitop-markiertes cry2 in Pflanzen exprimiert und spezifisch über Immunpräzipitation in Mengen aufgereinigt, die eine Identifizierung der gebundenen Chromophore ermöglichte. Die Ergebnisse von Fluoreszenz-Emissionsspektroskopie zeigten, dass cry2 in planta sehr wahrscheinlich beide Cofaktoren, FAD und MTHF, bindet. Zusätzlich ergaben diese Untersuchungen Hinweis auf Energietransfer von MTHF auf FAD. Augrund der Ähnlichkeit von Photolyasen und Cryptochromem in ihrer Aminosäuresequenz and Struktur wurde die Photochemie von Photolyasen als Modell für den Photozyklus von Cryptochromen benutzt. Allerdings zeigten in vitro Untersuchungen, dass Cryptochrome nach Anregung mit Blaulicht semireduziertes Flavin (FADHo) akkumulieren, im Gegensatz zu Photolyasen, die vollständig reduziertes Flavin (FADH-) bilden. Zu Blaulicht zusätzlich gegebenes Grünlicht verschiebt das Gleichgewicht der Oxidationszustände von Flavin hin zu oxidiertem FAD und reprimiert cry2-kontrollierte Prozesse wie die Induktion der Blütenbildung. Hier durchgeführte Untersuchungen über die Wirkung von Grünlicht auf die Expression von Blühgenen lieferten zusätzliche Hinweise darauf, dass cry2 mit semireduziertem Flavin den aktiven Zustand dieses Photorezeptors repräsentiert. Zum weiteren Verständnis der Phosphorylierung von cry2 wurde versucht, das Protein aus Pflanzen in Mengen zu isolieren, die für nachfolgende massenspektrometrische Analysen ausreichend sind. Leider wurde dieses Ziel nicht erreicht. Weiterhin wurden die Expression zahlreicher Gene in Arabidopsis Zellkulturen durch PCR- und quantitative real-time PCR-Analysen daraufhin untersucht, ob sie spezifisch durch Blaulicht reguliert werden. Einige Gene konnten hierbei identifiziert werden, die in zukünftigen Untersuchungen als Reporter genutzt werden können, um die Aktivität von Wildtyp und Mutanten Cryptochromen zu untersuchen.