Biochemical analysis of essential components involved in mitochondrial and cytosolic iron-sulfur protein biogenesis in Saccharomyces cerevisiae

Eisen-Schwefel (Fe/S) Cluster sind anorganische Kofaktoren zahlreicher prokaryotischer und eukaryotischer Proteine. Diese Fe/S Proteine übernehmen wichtige Aufgaben bei verschiedenen zellulären Prozessen, wie dem Elektronentransport, bei Enzymkatalysen oder bei der Genregulation. In Eukaryoten sind Fe/S Proteine in den Mitochondrien, den Chloroplasten, im Cytosol und im Zellkern lokalisiert. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae wird die Reifung der Fe/S Proteine von mindestens drei komplexen Maschinerien übernommen. Eine davon ist die in der mitochondrialen Matrix lokalisierte „iron-sulfur cluster“ (ISC) Assemblierungsmaschinerie, die an der Reifung aller zellulären Fe/S Proteine beteiligt ist. Dagegen werden die mitochondriale ISC-Export- und die „cytosolic iron-sulfur protein assembly“ (CIA) Maschinerien spezifisch nur für die Reifung cytosolischer und nukleärer Fe/S Proteine benötigt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde Isd11 als eine neue Komponente der mitochondrialen ISC-Assemblierungsmaschinerie in Hefe identifiziert. Isd11 ist ein essentielles Protein mit einer molekularen Masse von 11 kDa, das in der mitochondrialen Matrix lokalisiert ist. Es ist in allen Eukaryoten, nicht aber in Prokaryoten konserviert. Die Depletion von Isd11 durch regulierte Genexpression in einer Hefemutante führte zur Beeinträchtigung der Aktivität von mitochondrialen (z.B. Aconitase, Komplex II) und cytosolischen (Leu1) Fe/S Enzymen. Es wurden auch starke Defekte in der de novo Synthese von mitochondrialen, cytosolischen und nukleären Fe/S Proteinen beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Isd11 an der Reifung aller zellulären Fe/S Proteine beteiligt ist. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Isd11-defiziente Zellen eine fehl regulierte zelluläre Eisenhomöostase aufweisen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Isd11 eine neue Komponente der ISC-Assemblierungsmaschinerie ist. Isd11 bildet einen stabilen Komplex mit der Cystein-Desulfurase Nfs1 und interagiert, vermutlich indirekt über Nfs1, mit dem Gerüstprotein Isu1. Zwar wird Isd11 nicht für eine in vitro Aktivität von Nfs1 benötigt, doch führte die Depletion von Isd11 zu einer stark verminderten Synthese von Fe/S Clustern auf Isu1. Damit kommt Isd11 eine in vivo Funktion in der frühen Phase der Fe/S Proteinbiogenese zu. Obwohl Isd11 nicht für die Aktivität von Nfs1 erforderlich ist, stellt ihr Komplex die physiologische Cystein-Desulfurase dar, die zur Assemblierung eines Fe/S Clusters auf Isu1 benötigt wird. Im zweiten Teil der Arbeit lag der Schwerpunkt auf der molekularen und funktionellen Charakterisierung von Nar1, einem Protein der erst vor kurzem identifizierten CIA Maschinerie. Diese Maschinerie wird für die Biogenese von extra-mitochondrialen Fe/S Proteinen benötigt und umfasst neben Nar1 noch mindestens die drei Proteine Cfd1, Nbp35 und Cia1. Nar1 ist ein Fe/S Protein und enthält vermutlich zwei gekoppelte Fe/S Cluster. Nar1 der Hefe ist ein hoch konserviertes Protein, das Homologien zu bakteriellen Fe-Hydrogenasen aufweist und acht konservierte Cysteinreste enthält. Je vier davon sind am N- und C-Terminus lokalisiert. Für eine Charakterisierung von Nar1 war es wichtig zu untersuchen, ob die konservierten Cysteinreste für die Koordination der beiden Fe/S Cluster benötigt werden. Mit Hilfe einer gerichteten Mutagenese wurde gezeigt, dass drei der vier N-terminalen Cysteinreste (C59, C62 und C65) für das Überleben der Hefe essentiell waren. Ein Austausch der Cysteinreste zu Alanin- oder Serinresten führte zum reduzierten Einbau von radioaktivem Eisen-55 (55Fe) in die Fe/S-Proteine Leu1 und Rli1, sowie zum Verlust der Enzymaktivität von Leu1. Beides wies auf eine essentielle Rolle der entsprechenden Cysteinreste für die Funktion von Nar1 bei der Reifung extra-mitochondrialer Fe/S Proteine hin. Die Mutation von jeweils einem der drei N-terminalen Cysteinreste führte zu einem fast kompletten Verlust an gebundenem Fe/S Cluster. Eine Mutation des vierten N-terminalen Cysteins (C20A) alleine zeigte keinen Effekt, jedoch führte die kombinierte Mutation von C20 und C65 zu einem stärkeren Phänotyp der C65 Mutante. Diese Daten legen nahe, dass alle vier N-terminalen Cysteinreste koordinierende Liganden sind. Überdies weisen die Ergebnisse darauf hin, dass der N-terminale Fe/S Cluster für die Assemblierung des zweiten Fe/S-Zentrums benötigt wird. Interessanterweise hatten Mutationen einzelner Cysteinreste am C-Terminus in vivo keinen Einfluss auf den Einbau von Fe/S Clustern in Nar1. Wurden jedoch zwei C-terminale Cysteinreste gleichzeitig ausgetauscht, so führte dies zum Verlust des C-terminalen, nicht jedoch des N-terminalen Fe/S Clusters. Damit konnte diese Studie zum einen belegen, dass die N- und C-terminalen Cysteinreste jeweils einen Fe/S Cluster koordinieren, und zum anderen, dass beide Fe/S Cluster essentiell für die Funktion von Nar1 bei der Reifung extramitochondrialer Fe/S Proteine sind. Darüber hinaus war der N-terminale Fe/S Cluster labiler als derjenige am C-Terminus. Eine Erklärung für diese Beobachtung ergibt sich aus der modellierten Struktur von Nar1, die aus der Kristallstruktur von Fe-Hydrogenasen berechnet wurde. Im Strukturmodel von Nar1 ist der N-terminale Fe/S Cluster zur Proteinoberfläche hin exponiert, während der C-terminale Fe/S Cluster im Inneren des Proteins verborgen liegt.