In vitro and in vivo investigations on the interaction of bacterial RNase P with tRNA 3’-CCA

Die bakterielle RNase P katalysiert die Reifung von ptRNAs. In Bakterien besteht die RNAse P aus einer RNA- (P RNA, kodiert durch rnpB; ~ 400 nt) und einer Protein-Untereinheit (P Protein; kodiert durch rnpA; ~ 120 aa). In vitro unter erhöhten Salzkonzentrationen ist die RNA-Untereinheit katalytisch aktiv. Unter physiologischen Bedingungen ist die Protein-Untereinheit essentiell für die katalytische Aktivität. Typ A und Typ B RNase P RNAs sind in vivo austauschbar Es konnte gezeigt werden, dass die bakteriellen RNase P RNAs vom strukturellen Typ A und Typ B sich gegenseitig vollständig in vivo ersetzen können, trotz der vielen dokumentierten Unterschiede in der Biogenese, in den biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften und in der Enzymfunktion in vitro. Die Ergebnisse deuten an, dass viele der berichteten Eigenheiten der RNase P Enzyme vom Typ A und B entweder nicht die in vivo-Situation widerspiegeln oder für die Funktion in vivo nicht kritisch sind, zumindest unter Standardwachstumsbedingungen. Die Interaktion des 3’-CCA Endes von ptRNAs mit E. coli RNase P RNA ist essentiell in vivo Die L15-Region der E. coli RNase P RNA bildet zwei Watson-Crick Basenpaare mit dem 3’-CCA Ende von Vorläufer tRNAs (G292-C75 und G293-C74). Im Rahmen dieser Arbeit wurde der in vivo-Phenotyp untersucht, der mit einer Zerstörung des G292-C75 oder G293-C74 Basenpaares assoziiert ist. Die mutanten RNase P RNA-Allele (rnpBC292 and rnpBC293) verursachten einen schweren Wachstumsdefekt in dem E. coli rnpB-Mutantenstamm DW2 und vernichteten das Wachstum vollständig in dem neu konstruierten E. coli Mutantenstamm BW, in dem die Expression des chromosomalen rnpB-Gens strikt von der Anwesenheit von Arabinose abhängt. Am Beispiel der Prozessierung von Vorläufer-4.5S RNA konnte gezeigt werden, dass ein isosterisches C293-G74 Basenpaar, jedoch nicht ein C292-G75 Paar, die katalytische Funktion in vivo vollständig wiederherstellt. Dies demonstriert, dass die Identität der Base G292, jedoch nicht von G293, zum katalytischen Prozess in vivo beiträgt. Aktivitätsassays mit in vivo und in vitro assemblierten Holoenzymen zeigten, dass die C292/C293-Mutationen einen schweren funktionellen Defekt bei niedrigen Mg2+-Konzentrationen (2 mM) verursachen, welcher auf Ebene der Rekrutierung von katalytisch aktivem Magnesium anzusiedeln ist. Bei 4.5 mM Mg2+ war die Aktivität der mutanten relativ zum Wildtyp-Holoenzym nur ca. 2-fach erniedrigt, jedoch 13-24-fach bei 2 mM Mg2+. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass es unwahrscheinlich ist, dass Defekte in der Proteinbinding, Substrataffinität oder RNA-Stabilität signifikant zum C292/C293-Phenotyp beitragen. In nativen PAGE-Experimenten wurden jedoch nicht-identische Faltungsgleichgewichte für Wildtyp vs. mutanten RNase P RNAs aufgedeckt, welche sowohl puffer- als auch präinkubationsabhängig waren. Deshalb kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine veränderte Faltung der mutanten RNAs zum in vivo Defekt partiell beiträgt. Die Rolle der Interaktion zwischen Typ B RNase P und dem tRNA 3’-CCA Ende in vivo Bisher war es unklar, ob RNase P vom Typ B eine spezifische Interaktion mit dem 3’-CCA Ende von Vorläufer tRNAs (ptRNAs) eingeht und ob diese Wechselwirkung gegebenenfalls für den katalytischen Prozess eine Rolle spielt. Es konnte gezeigt werden, dass Punktmutationen der zwei Guanosine im L15-Loop, für welche eine Interaktion mit dem 3’-CCA Ende vermutet wird, das Zellwachstum hemmen (S. aureus rnpB) oder unterdrücken (B. subtilis oder E. coli rnpB). Dies korreliert mit einem Enzymdefekt bei niedrigen Mg2+-Konzentrationen. Für B. subtilis RNase P stellte ein isosterisches C259-G74 Basenpaar die katalytische Prozessivität vollständig wieder her, während ein C258-G75 Basenpaar nur einen schwachen Kurierungseffekt bewirkte. Dies weist auf eine Waston-Crick Basenpaarung der zwei Guanosine mit dem 3’-CCA Ende von tRNAs hin und unterstreicht zugleich die Wichtigkeit der Basenidentität an der Postition G258. Kinetische Untersuchungen lassen die Folgerung zu, dass der Defekt der mutanten Enzyme hauptsächlich auf Ebene der Rekrutierung von katalytisch aktivem Mg2+ anzusiedeln ist. Die Lebensfähigkeit der Bakterien, welche mutierte RNase P RNA exprimierten, konnte (teilweise) durch parallele Überexpression des B. subtilis RNase P Proteins wiederhergestellt werden; dieser Effekt konnte auf erhöhte intrazelluläre RNase P-Mengen zurückgeführt werden. Des weiteren konnte gezeigt werden, das B. subtilis RNase P 3’-Vorläufer tRNAs ohne 3’-CCA Ende in vivo prozessieren kann. Wir folgern daraus, dass der in vivo-Phenotyp, der mit einer Unterbrechung der CCA-Interaktion assoziiert ist, entweder durch eine globale kinetische Verlangsamung der 5’-Reifung von tRNAs oder durch eine kritische Blockierung der 5’-Maturierung einer Subgruppe von tRNAs verursacht wird.