The surfactin biosynthetic complex of Bacillus subtilis: COM domain-mediated biocombinatorial synthesis, and single step purification of native multi-modular NRPSs and multi-enzyme complexes

Die meisten Biosynthese-Matrizen von Peptid-Naturstoffen sind aus mehreren nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) aufgebaut. Der Biosynthese-Komplex des Lipopeptid-Antibiokums Surfactin z.B. besteht aus drei NRPSs (SrfA-A, SrfA-B und SrfA-C), welche vom polycistronischen srfA Operon des Produzentenstammes B. subtilis kodiert werden. Aufgrund der molekularen Logik der nichtribosomalen Peptidsynthese erfordert die Biosynthese eines definierten Produktes eine ausschließliche Interaktion von Partner-Enzymen (z.B. SrfA-A/SrfA-B und SrfA-B/SrfA-C). Anhand von in vitro Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass diese selektiven Wechselwirkungen von Kommunikations-vermittelnden (communication-mediating, COM) Domänen kontrolliert werden, welche am C- bzw. N-Terminus der entsprechenden Donor- oder Akzeptor-Enzyme lokalisiert sind. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden das Potential von COM-Domänen zur Umpro-grammierung des Surfactin-Biosynthese-Komplexes, sowie zur Generierung eines in vivo Systems zur biokombinatorischen Synthese von Lipopeptiden ausgenutzt. Hierfür wurde das erste COM-Domänenpaar (zw. SrfA-A und SrfA-B), gegen unterschiedliche verwandte, mis-verwandte und nicht-verwandte COM-Domänenpaare ausgetauscht. Die Auswirkungen dieser Manipulationen wurden anschließend mittels HPLC und MS analysiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass COM-Domänenpaare des Tyrocidine-Biosynthese-Komplexes auch im heterologen Wirt und NRPS-System ihre uneingeschränkte Funktionalität und Selektivität bewahren. Des weiteren konnte durch die Verwendung eines nicht-verwandten COM-Domänenpaares die tri-modulare Peptidsynthetase SrfA-B gezielt übersprungen und eine produktive Interaktion zwischen den nativen Nicht-Partner-Enzymen SrfA-A und SrfA-C etabliert werden. Dieses Übergehen von SrfA-B führte zur Bildung eines verkürzten Lipotetrapetid-Produktes. In einem weiteren Test wurden alle Donor- und Akzeptor-Enzyme mit demselben cognaten COM-Domänenpaar ausgestattet. Die hiermit verbundene Aufhebung der Selektivitätsbarriere führte zur Etablierung eines universellen Kommunikationssystems (universal communication system, UCS), sowie zur gleichzeitigen, biokombinatorische Synthese von zwei Lipopeptid-Produkten. All diese Ergebnisse verifizierten die entscheidende Bedeutung von COM-Domänen für die Kontrolle der Protein-Protein-Kommunikation zwischen NRPSs erstmals in vivo und im Kontext eines natürlichen NRP-Montagebandes. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine schonende Methode zur Reinigung von NRPSs und multi-enzymatischen NRPS-Biosynthese-Komplexen entwickelt. Grundlage hierfür bildete die Verwendung von polyol-responsiven monoklonalen Antikörpern (PR-mAk), welche in der Lage sind ihr Antigen unter schonenden, nicht-denaturierenden Bedingun-gen – in Anwesenheit von Polyolen – freizusetzen. Diese Antikörper wurden erstmals für die Reinigung des E. coli RNA-Polymerase-Komplexes samt der locker gebundenen -Faktoren verwendet, was u.a. zur Identifizierung des Antigen/Antikörper-Paares Epitop/NT73 führte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der codierende Bereich dieses Epitops an das 3’-Ende des srfA-A Gens fusioniert. Anschließend konnte das kodierte Protein SrfA-A-epi aus Rohextrakten des entsprechenden B. subtilis-Stammes mittels Immunoaffinitäts-Chromatographie gereinigt werden. SDS-PAGE und MS/MS Analysen, sowie biochemische Charakterisierungen verifizierten hierbei die Reinigung von SrfA-A-epi in aktiver holo-Form, sowie im Komplex mit seinem natürlichen Partner-Enzym SrfA-B (Molekularmasse des dimeren Komplexes: ca. 803 kDa).