Structural and Functional Studies of tRNA-Guanine Transglycosylase: A putative Drug Target for Shigellosis Therapy

In der vorliegenden Arbeit werden Ansätze zur strukturbasierten Entwicklung von Hemmstoffen der eubakteriellen tRNA – Guanin Transglykosylase (TGT) aus Zymomonas mobilis vorgestellt. In Untersuchungen an Shigella flexneri, dem Verursacher der Bakterienruhr, konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der TGT die Pathogenität wesentlich beeinflusst. Von der S. flexneri TGT ist, im Gegensatz zu der in der Aminosäuresequenz sehr ähnlichen Z. mobilis TGT, keine Kristallstruktur verfügbar. Das Auffinden von Hemmstoffen der Z. mobilis TGT könnte zur Entwicklung eines wirksamen Antibiotikums gegen Bakterienruhr beitragen. Im ersten Teil dieser Arbeit werden funktionelle und strukturelle Untersuchungen präsentiert, die den Mechanismus der von TGT katalysierten Basenaustausch-reaktion genauer beschreiben. Aus dem Vergleich von Kristallstrukturen der eubakteriellen Z. mobilis QueTGT und der archaebakteriellen Pyrococcus horikoshii ArcTGT, jeweils im Komplex mit tRNA, wurde ein detailliertes Modell zum Verlauf der Basenaustauschreaktion entwickelt. Die Analyse der verfügbaren Strukturen deutet auf einen bei Prokaryoten und Eukaryoten hochkonservierten Reaktionsverlauf hin. Außerdem bestätigt die Analyse der beiden tRNA gebundenen Strukturen eine in der Literatur bereits vermutete Zuordnung der TGT Superfamilie zu einer Gruppe von Superfamilien, die ein spezielles Phosphatbindemotiv beinhalten. In QueTGT Kristallstrukturen zweier Organismen wurden strukturell konservierte Dimere entdeckt. Der Vergleich von TGT Sequenzen aus 21 Arten gibt, zusammen mit der tRNA gebundenen Z. mobilis TGT Kristallstruktur, deutliche Hinweise darauf, dass TGT-Dimerbildung bei Eubakterien und Eukaryoten funktionell relevant ist. Für QueTGT wurde gezeigt, dass eine für den Basenaustausch funktionell und strukturell wichtige Konformationsänderung der Bindetasche über die generelle Säure/Base Glu235 gesteuert wird. Dieses Anpassungsvermögen ermöglicht allerdings auch Substratpromiskuität. In begrenztem Umfang ist der Einbau von preQ0 möglich, dem biosynthetischen Vorläufer des natürlichen Substrates preQ1. In einer Glu235Gln- Mutationsstudie konnte gezeigt werden, dass sich die Selektivität zugunsten von preQ0 verschieben lässt. Kristallstrukturanalysen zeigten jedoch, das die preQ0 selektive Bindetasche in der Mutante auf eine unerwartete Weise stabilisiert wird. Die Erkenntnisse über Struktur und Funktion der TGT wurden im zweiten Teil dieser Arbeit in die strukturbasierte Hemmstoffentwicklung einbezogen. Alle in dieser Arbeit untersuchten Verbindungen wurden von Kooperationspartnern zur Verfügung gestellt. Zunächst wurde das zuvor etablierte Testsystem modifiziert, um in Abhängigkeit von Molekülgröße und Ähnlichkeit zu den Substratbasen kompetitive und unkompetitive Hemmbeiträge zu berücksichtigen. Es folgte eine umfangreiche kinetische Neubestimmung bereits publizierter Hemmstoffe, die der Revalidierung der Struktur – Wirkbeziehung diente. Im Anschluss daran wurden drei Ansätze zur strukturbasierten Entwicklung von Hemmstoffen genauer verfolgt. Im ersten und erfolgreichsten Ansatz wurde lin-Benzoguanin als neue Leitstruktur etabliert. Kristallstrukturanalysen zeigen, dass lin-Benzoguanine Konformations-änderungen induzieren, die die Bindetasche vergrößern. In ähnlicher Weise können diese Modifikationen auch in der tRNA gebundenen TGT Struktur beobachtet werden. Zwei strukturell wichtige Wassermoleküle sind in diesen Prozess involviert. 2- und 4-substituierte lin-Benzoguaninderivate ermöglichten es, günstige und ungünstige Beiträge zur Bindungsaffinität abzuleiten. 4-Substituierte Verbindungen verdrängen ein Wassernetzwerk im Bereich des negativ geladenen Nukleophils Asp280. Vermutlich in Folge einer Störung der Ladungskompensation ist eine leichte Affinitätsabnahme zu beobachten. 2-Substituierte Verbindungen gewinnen im Vergleich zum Grundgerüst Affinität um eine Faktor 10 und hemmen im nanomolaren Bereich. Vermutlich weisen sie einen ladungsunterstützten Bindemodus auf, der für den signifikanten Affinitätsgewinn hauptverantwortlich zu sein scheint. In einem zweiten Ansatz sollte eine aus einem virtuellen Screening stammende Leitstruktur optimiert werden, für die ein ungewöhnlicher Bindemodus vorhergesagt worden war. Serien von 1- und 5-substituierten Derivaten von Benzimidazolin-2-on/-thion zeigten Inhibitionskonstanten im Bereich von 2 – 150 µM. Da Kristallstrukturanalysen im Komplex mit TGT bislang erfolglos blieben, kann noch keine Aussage über Struktur – Wirkbeziehungen getroffen werden. Im dritten Ansatz wurden kinetische und kristallographische Untersuchungen von Apigenin-basierten Verbindungen durchgeführt, die mit der Methode des „Ligandenfischen“ aus Pflanzenextrakten isoliert worden waren. Ihre Inhibitionskonstanten liegen im Bereich von 20 – 90 µM. Auch hier waren Kristallstrukturanalysen erfolglos. Selbst das Platzieren der Verbindungen mit computerbasierten Methoden in der TGT Bindetasche ergab keine einheitlichen Resultate. So bleiben auch in diesem Fall die Struktur – Wirkbeziehungen bis auf weiteres spekulativ.