Insulin nanocomplexes formed by self-assembly from amine-modified poly(vinyl alcohol)-graft-poly(L-Lactide) for non-invasive mucosal delivery: Preparation, characterization and in vivo investigations

In dieser Arbeit wurden bioabbaubare DEAPA-PVAL-g-PLLA Nano-Komplexe als kolloidales Protein-Trägersystem zur nicht-invasiven, transmukosalen Insulin-Applikation untersucht. Kapitel 1 beschreibt die Grundlagen der Insulin-Therapie, den Forschungsstand, sowie Probleme und zukünftige Entwicklungen. Die Entstehung von Diabetes Mellitus und die verschiedenen Behandlungsmöglichkeiten werden vorgestellt, um die bestehende Notwendigkeit von alternativen, nicht-invasiven Applikationssystemen zu verdeutlichen. Es wurde herausgestellt das die Epithel-Barriere und der enzymatische Abbau eine effektive transmukosale Insulin-Aufnahme verhindern. Das Potential von kolloidalen, bioadhäsiven polymeren Trägern für die orale, pulmonale und nasale Appplikation für Insulin wird hervorgehoben. Faktoren wie Bioadhäsivität und Komplex-Bildungsvermögen von Polymeren werden im Hinblick auf die Literatur erklärt. Im Kapitel 2 werden die Polymere bezüglich ihres Substitutionsgrades und des Pfropfungsgrades charakterisiert. Es war möglich durch Einstellung von Faktoren wie Molekulargewicht, PLLA Kettenlänge und Amin-Substitution, das hydrophile-hydrophobe Gleichgewicht der Polyester zu beeinflußen. Die Wasserlöslichkeit dieser Polymere ermöglichte deren spontanes Zusammenfügen mit Insulin zu kleinen Komplexen im Nanometer-Bereich mit enger Größenverteilung. Die Herstellung der Nano-Komplexe wurde im Hinblick auf Größenverteilung, Oberflächenladung und Insulin-Bindungskapazität beschrieben. Untersuchungen mit isothermaler Titrationskalorimetrie zeigten den Einfluß von Strukturmerkmalen auf die Bindungskonstante. Ein Anstieg der Bindungsaffinität, der Beladung, des Zetapotentials und eine Verringerung der Komplexgröße konnte mit einem höheren Substitutionsgrad von DEAPA-Gruppen und einem höheren Pfropfungsgrad des Rückgrates korreliert werden. Eine systematische Untersuchung des Komplexbildungsprozesses mit Hilfe von Trübungsmessungen und Streulichtmethoden, ermöglichte die Ermittlung von optimalen Verhältnissen der Bindungspartner. Die Komplexe wurden mit Hilfe von Rasterkraftmikroskopie dargestellt und zeigten ein homogenes Partikelkollektiv mit sphärischen Komplexen und einer knäuelartigen internen Struktur. Im Kapitel 3 wurde die Eignung von Insulin Nano-Komplexen für die nasale Insulin-Applikation in-vivo an Wistar-Ratten untersucht. Änderungen der Glukose- und Insulinkonzentration im Blut der betäubten Ratten wurde mit Hilfe eines Blutzuckermessgerätes und ELISA verfolgt. Der Verlauf der Blutglukose zeigte einen signifikanten Abfall der Glukosekonzentration, begleitet von einer ansteigenden Konzentration exogenen Insulins im Rattenblut. Von den beiden untersuchten Komplextypen zeigte sich die amphiphile gepfropfte Variante, im Vergleich zu dem hydrophilen Rückgrat ohne Pfropfung, als besser geeignet. Der pharmakologische Effekt, der an gesunden Ratten beobachtet wurde, konnte an Streptozotocin induzierten, diabetischen Ratten wiederholt werden und zeigte die in-Vivo Wirkung damit auch an der eigentlichen erkrankten Zielgruppe. Ein signifikanter Anstieg der relativen Bioverfügbarkeit wurde bei höheren Konzentrationen der gepfropften Variante beobachtet. Nach einmaliger Applikation der Nano-Komplexe zeigten die histologischen Untersuchungen der nasalen Mukosa mit dem Lichtmikroskop keine toxischen Effekte auf das nasale Zellgewebe am Applikationsort. Im Kapitel 4 wird die Wechselwirkung von DEAPA-PVAL-g-PLLA Nano-Komplexen mit der Darmzelllinie Caco-2 im Hinblick auf Zelltoxizität, Transport durch und Aufnahme in die Zellschicht untersucht. Die Nano-Komplexe wurden mit einer Nano-Partikel Formulierung verglichen, die aus einer stark gepfropften Variante von DEAPA-PVAL-g-PLGA mittels Solvent-Displacement-Verfahren hergestellt wurde. Die vorgefertigten Nano-Partikel wurden durch Adsorption von Insulin an die Partikeloberfläche beladen. Der Vergleich der Insulin-Aufnahme fördernden Wirkung zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen Partikel- und Komplex-Formulierung. Allerdings zeigten die physiko-chemischen Eigenschaften der Nano-Komplexe und deren Wechselwirkung mit Caco-2 Zellen eine starke Abhängigkeit von der Polymerstruktur. Die erfolgreichste Variante bestand aus einem hydrophilen Rückgrat und hydrophoben Seitenketten. Diese Kombination verstärkt jedoch den amphiphilen Charakter des Polymers und damit seine Oberflächenaktivität. Eine Eigenschaft die möglicherweise Schäden an der Membran und den Tight Junctions verursachte, wie durch LDH Freisetzung und den Abfall des transepithelialen Widerstandes angedeutet wurde. Nicht zuletzt weil dieser Effekt reversibel war und Nano-Komplexe mit höherem Propfungsgrad den besten Schutz vor Trypsin-Abbau, die höchste Zellaufnahme und den höchsten Transport durch Caco-2 Zellen aufwiesen, scheint dieses Trägersystem für Insulin geeignet zu sein mukosale Aborptions-barrieren zu überwinden.