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In vivo-Analysen zur Funktion bakterieller RNase P-Proteine in Bacillus subtilis
Das RNase P-Enzym katalysiert die Prozessierung der 5Ž-Enden aller tRNAs in der Zelle. Die bakterielle Endoribonuklease besteht aus einer katalytischen RNA-Untereinheit (kodiert von rnpB) und einer Proteinuntereinheit (kodiert von rnpA). Für Komplementations-Analysen wurde ein Bacillus subtilis-Sta...
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| Format: | Dissertation |
| Langue: | allemand |
| Publié: |
Philipps-Universität Marburg
2004
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| Accès en ligne: | Texte intégral en PDF |
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| Résumé: | Das RNase P-Enzym katalysiert die Prozessierung der 5Ž-Enden aller tRNAs in der Zelle. Die bakterielle Endoribonuklease besteht aus einer katalytischen RNA-Untereinheit (kodiert von rnpB) und einer Proteinuntereinheit (kodiert von rnpA).
Für Komplementations-Analysen wurde ein Bacillus subtilis-Stamm mit regulierbarer rnpA-Genexpression konstruiert. Hierfür wurde das chromosomale rnpA-Gen durch homologe Rekombination gegen ein rnpA-Gen mit Xylose-Promotor (Pxyl) ausgetauscht. Mittels RT-PCR-Analysen konnte gezeigt werden, daß die chromosomale rnpA-Expression in der konstruierten B. subtilis-Mutante effektiv inhibiert werden kann. Die Expression von rnpA wurde in Gegenwart von Xylose induziert. Der Wachstumsdefekt der Mutante in Abwesenheit von Xylose konnte durch plasmidkodiertes, homologes RNase P-Protein aufgehoben werden. Auf diese Weise konnte direkt in vivo gezeigt werden, daß das rnpA-Gen in B. subtilis essentiell ist.
Mit dem B. subtilis-Stamm wurden anschließend heterologe Komplementationsstudien durchgeführt, um in vivo die Funktionalität von RNase P-Proteinen aus phylogenetisch entfernt verwandten Bakteriengattungen zu untersuchen. Die plasmidkodierten, heterologen RNase P-Proteine von Escherichia coli und Synechocystis sp. PCC6803 waren beide in der Lage, die essentiellen Funktionen des nativen RNase P-Proteins in B. subtilis zu ersetzen.
Ferner konnte demonstriert werden, daß die B. subtilis-Mutante für die Überexpression und affinitätschromatographische Isolierung funktioneller, in vivo assemblierter RNase P genützt werden kann. Dies gelang durch die Transformation der Mutante mit einem Expressionsvektor, der sowohl für ein RNase P-Protein mit His-tag als auch für die RNase P-RNA kodiert. |
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| DOI: | 10.17192/z2004.0529 |