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Molekulare Untersuchungen zur Spezifität von Polyketidsynthasen aus Dictamnus albus L. und Ruta graveolens L.
Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Funktionsweise von Polyketidsynthasen (PKS) zu leisten. Hierzu wurden Mutagenesestudien sowie biochemische Untersuchungen an Chalkonsynthase (CHS) und Acridonsynthase (ACS) aus Ruta graveolens durchgeführt. N...
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| 格式: | Dissertation |
| 語言: | German |
| 出版: |
Philipps-Universität Marburg
2004
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| 主題: | |
| 在線閱讀: | PDF-Volltext |
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| 總結: | Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zur
Aufklärung der molekularen Funktionsweise von
Polyketidsynthasen (PKS) zu leisten. Hierzu wurden
Mutagenesestudien sowie biochemische Untersuchungen an
Chalkonsynthase (CHS) und Acridonsynthase (ACS) aus Ruta
graveolens durchgeführt. Neben den bereits vorliegenden Enzymen
aus Ruta sollte die Klonierung weiterer PKS aus Dictamnus albus
Vergleiche in einem homologen System ermöglichen. Die
Umwandlung der Ruta-ACS in eine funktionelle CHS wurde
erfolgreich abgeschlossen. Es konnte gezeigt werden, dass es
mit nur drei Mutationen möglich ist, die ACS-Aktivität auf
wenige Prozent des ursprünglichen Umsatzes zu senken und
gleichzeitig die Fähigkeit zur Bildung des Naringeninchalkons
deutlich zu steigern, so dass dies nun die Hauptaktivität der
hergestellten Mutante ist. Der umgekehrte Weg, die Umwandlung
der CHS in eine ACS, gestaltete sich schwieriger. Es wurden
zahlreiche Hinweise auf notwendige Bedingungen für diesen
offensichtlich komplizierteren Weg erarbeitet. So konnten bei
der Mutante Rk1 unter bestimmten Bedingungen eine geringe
ACS-Aktivität gemessen werden. Des Weiteren zeigten Hemmtests,
dass die Bindung des Startsubstrats N-Methylanthraniloyl-CoA in
allen CHS-Mutanten möglich ist, im Gegensatz zur Wildtyp-CHS.
Die folgende Charakterisierung zeigte, dass die Mutanten Rk1
und Rk2 in erhöhtem Maße Anthraniloyl-CoA, das postulierte
Startsubstrat der Hydroxychinolonsynthase (HQS), umsetzen.
Erste Hinweise deuten darauf hin, dass die vorgenommenen
Mutationen der CHS nicht nur zur teilweisen Umwandlung in eine
ACS geführt haben, sondern möglicherweise auch zu einer HQS.
Mit der Klonierung und funktionellen Expression der
Chalkonsynthase aus Diptam steht eine weitere PKS aus der
Familie der Rutaceae zur Verfügung. Der Vergleich mit bereits
bekannten Sequenzen erbrachte Hinweise auf weitere
Sequenzstellen, durch deren Austausch die bisher unvollständige
Umwandlung der CHS in eine Acridonsynthase erreicht werden
könnte. Die noch ausstehende Klonierung der HQS wird dazu
beitragen, die Fragen, die sich aus den unterschiedlichen
Substratspezifitäten der untersuchten Enzyme und Mutanten
ergeben haben, zu beantworten. |
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| DOI: | 10.17192/z2004.0127 |