Drug Delivery of Oligonucleotides at the Blood-Brain Barrier: a Therapeutic Strategy for Inflammatory Diseases of the Central Nervous System

In this project a vector for drug delivery into brain endothelial cells, consisting of an anti-transferrin receptor antibody and a complex of polyethylenimine (PEI) and an oligodeoxynucleotide (ODN) drug was evaluated. NF-kB decoys are short double-stranded ODNs, which contain a recognition sequence...

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Main Author: Osburg, Berit
Contributors: Voigt, Karlheinz Prof. Dr. med. (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2003
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Table of Contents: In diesem Projekt sollte ein Vektor zur "Drug delivery" an Hirnendothelzellen, bestehend aus einem monoklonalen Antikoerper gegen den Transferrinrezeptor und einem Komplex aus Polyethylenimin (PEI) / Oligodeoxynukleotid (ODN) untersucht werden. NF-kB "decoys" sind kurze doppelsträngige Oligodeoxynukleotide, welche eine Erkennungssequenz für die Bindung des Transkriptionsfaktors enthalten. Durch die Bindung an den Transkriptionsfaktor NF-kB verhindern sie die Transkription von verschiedenen, in entzündliche Prozesse involvierte Genen. Adhäsionsmoleküle fördern die Transmigration von aktivierten T-Lymphozyten über die Blut-Hirn-Schranke (BHS), die zu Entzündung und zu einer Demyelinisierung von Axonen im Gehirn führt. Dieser Zustand wurde in entzündlichen Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS) gesehen. Die Hemmung der Transkription dieser Gene kann durch verminderte Lymphozytentransmigration zu therapeutischen Effekten führen. Der Ratte-anti-Maus-Antikörper 8D3 gegen den Transferrinrezeptor wurde aus Hybridommedium gereinigt und an Streptavidin gekoppelt, um biotinylierte Liganden binden zu können. Zur Vektoranalyse wurden in vivo Pharmakokinetikstudien und in vitro Bindungsstudien durchgeführt. Die Pharmakokinetikstudien zeigten eine vergleichbare Halbwertszeit und Fläche unter der Plasmakurve (Area under the plasma curve = AUC) des Antikörperkonjugates und freien 8D3 Antikörpers im Plasma. Immunhistochemie an der Hirnendothelzelllinie bEnd5 zeigte ein ähnliches Bindungsverhalten für den Antikörper und das Streptavidinkonjugat. Die Spezifität der Aufnahme von 3H-Biotin-8D3-SA durch die bEnd5 Zellen wurde in Experimenten bestätigt, die entweder mit einem Säurewaschschritt zur Entfernung aller oberflächengebundenen Antikörper oder durch Anwendung des Maus-anti Ratte-Transferrinrezeptor-Antikörpers OX26 durchgeführt wurden. Der biotinylierte Ligand, der in diesem Projekt verwendet wurde, war ein Polymer – Polyethylenimin (PEI), das in der Lage ist, eine doppelsträngige 20 Basenpaare lange Sequenz (NF-kB "decoy") zu komplexieren. Das PEI mit niedrigem Molekulargewicht (low molecular weight = LMW PEI) mit 2700Da wurde für dieses Projekt gewählt, weil es durch solche positiven Eigenschaften wie geringe Zytotoxizität, hohe Transfektionsraten und enge Größenverteilung bekannt ist. PEI wurde kovalent mit einem biotinylierten PEG modifiziert, um die Kopplung an den Vector zu ermöglichen. Wir führten Stabilitätsstudien zur Analyse der Komplexeigenschaften in Salzlösungen unter Zusatz von 10% oder 20% Plasma und Inkubation des Komplexes in Medium über einen längeren Zeitraum durch. Partikelgrößenmessungen in PBS mit einem pH-Wert von 7.4 zeigten eine optimale Größenverteilung des bioPEGPEI/NF-kB-decoy Komplexes mit einem PEI-Amino/ODN-Phosphat (N/P) Verhältnis von 6:1 und eine durchschnittliche Partikelgröße von 120nm, welche für mindestens eine Woche stabil war. Gelretardationsassays zeigten bei diesem N/P-Verhältnis ebenfalls eine vollständige Komplexierung von PEI und ODN. Die Zugabe des 8D3-SA erhöhte die Komplexgröße um 40nm. Pharmakologische Effekte von bioPEGPEI/NF-kB decoy in vitro konnten nach der Behandlung der bEnd5 Zellen mit verschiedenen Konzentrationen der NF-kB "decoys" über einen Zeitrahmen von 48 Stunden beobachtet werden. Eine Hemmung der mRNA für VCAM-1 (Isoform1 und 2) war bereits nach 12 Stunden sichtba,r mit einem stetigen Anstieg des inhibitorischen Effektes bis zu 48 Stunden. Die Pharmakonkonzentrationen von 5uM zeigten eine nahezu vollständige Supprimierung der VCAM-1-Expression. Kopplung des Pharmakons an den Vektor führte zu einer Reduktion der Konzentration auf 0,5uM - 1uM, die zur Hemmung der Genexpression benötigt wird. Diese Ergebnisse sprechen für eine Erhöhung der Potenz des Pharmakon-Komplexes durch "targeting" an den Transferrinrezeptor. Pharmakokinetikstudien zeigten das Verhalten des bioPEGPEI/NF-kB-Komplexes mit verschiedenen N/P Verhältnissen. Bei einem N/P Verhältnis von 6:1 konnte die AUC im Vergleich zu freiem NF-kB verdoppelt werden. Die Kopplung an den Vektor veränderte die pharmakokinetischen Eigenschaften des Komplexes nicht wesentlich. Die "drug targeting" Methode, die in diesem Projekt untersucht wurde, stellt ein exzellentes Modell für in vitro Anwendungen dar. Weitere Untersuchungen zur in vivo Anwendung sind notwendig, mit dem Ziel einer weiteren Verbesserung der pharmakokinetischen Parameter (Erhöhung der AUC). Hierzu können weitere Modifikationen des bioPEGPEI erforderlich sein.