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Titel:Untersuchungen zu molekularen Mechanismen der Spannungsabhängigkeit des µ-Opioid Rezeptors
Autor:Ruland, Julia
Weitere Beteiligte: Bünemann, Moritz (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2020
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2021/0050
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2021-00500
DOI: https://doi.org/10.17192/z2021.0050
DDC: Pharmakologie, Therapeutik
Publikationsdatum:2021-01-21
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Arrestine,, GPCR, G-Protein-aktivierter einwärtsgleichrichten, Foerster Resonance Energy Transfer (FRET), MOR-signaling, G-protein coupled receptors (GPCRs), Förster Resonanz Energie Transfer (FRET), MOR-Signaltransduktion, G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), G-protein-activated inwardly rectifying K+ (GIRK) chann

Zusammenfassung:
In jüngerer Zeit haben eine Reihe von Studien gezeigt, dass die membranständigen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) in ihrer Funktion durch das elektrische Membranpotenzial beeinträchtigt werden. Diese spannungsabhängige Modulation kann je nach betrachtetem Rezeptor und je nach Liganden zu einer Aktivierung oder Deaktivierung führen, die aus Veränderungen in der Ligandenaffinität oder Effektstärke resultiert. Obwohl bereits eine Reihe von Rezeptoren charakterisiert werden konnten, bleibt der zugrundeliegende Mechanismus größtenteils unklar. Ebenso weiß man bis heute nicht viel über die pharmakologische Relevanz der Spannungsabhängigkeit in nativem Gewebe. In der vorliegenden Studie wurde der μ-Opioid-Rezeptor (MOR) in Bezug auf spannungssensitives Verhalten charakterisiert. Die physiologische Rolle des MOR liegt in einer Hemmung pronozizeptiver Signale auf prä- und postsynaptischer Ebene. Die wichtigsten Schmerzmittel zur Behandlung mittelstarker bis starker Schmerzen adressieren den MOR. Als neuronaler Rezeptor ist der MOR starken und hochfrequenten Änderungen im Membranpotenzial ausgesetzt. Die Spannungsabhängigkeit wurde in vorliegender Studie auf mehreren Ebenen beleuchtet: in der G-Protein-Aktivierung, ß-adrenergen Rezeptorkinase (GRK2, englisch G-protein coupled receptor kinase 2)- und Arrestin3-Interaktion wurde die Spannungssensitivität des MOR auf molekularer Ebene beobachtet, indirekt gemessen durch Protein-Protein-Interaktionen der Effektoren. Dies konnte durch einen Versuchsaufbau gewährleistet werden, der Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Messungen zwischen fluoreszent markierten Fusionsproteinen unter Manipulation des Membranpotenzials im whole-cell (englisch: ganze Zelle) Spannungsklemmen-Modus erlaubt. In weiteren Versuchen wurden die pharmakologischen Implikationen der Spannungsabhängigkeit des Rezeptors unter Manipulation des Membranpotenzials untersucht. Dafür wurden zum einen MOR-induzierte GIRK-Ströme (G-Protein-aktivierter, einwärtsgleichrichtender Kanal) in transfizierten HEK 293T Zellen in Einwärts- und Auswärtsrichtung aufgezeichnet und zum anderen Messungen der GIRK-Ströme in einzelnen Neuronen aus Locus Coeruleus (LC) Präparationen durchgeführt1. Auf molekularer Ebene wurde in allen untersuchten Interaktionen eine starke spannungsabhängige Steigerung der Morphin-induzierten Rezeptoraktivierung gefunden. Besonders ausgeprägte spannungsabhängige Auswirkungen fanden sich in der Fähigkeit des Morphin-aktivierten MORs, GRK2 und Arrestin3 zu rekrutieren. Morphin wurde in der Literatur bereits als Ligand mit niedriger intrinsischer Effektstärke charakterisiert und zeigt im Vergleich zu peptidergen Liganden (DAMGO, Met-Enkephalin) in nicht-depolarisierten Zellen nur eine geringfügige GRK2- und Arrestin3-Rekrutierung. Bei Depolarisation innerhalb der physiologischen Bandbreite an Membranpotenzialen zeigte sich allerdings eine mehrfache Steigerung der initialen Rekrutierung, die als gesteigerte Effektstärke identifiziert werden konnte. Im Gegensatz dazu reagierte der DAMGO-aktivierte MOR nur geringfügig spannungssensitiv und unter Met-Enkephalin konnte keine messbare Veränderung in Abhängigkeit des Membranpotenzials festgestellt werden. In einem kleinen Exkurs wurde weiterhin beobachtet, dass der hochpotente Ligand Fentanyl unter Depolarisation sogar eine Deaktivierung des Rezeptors zeigt, während der strukturell mit Morphin verwandte Ligand Buprenorphin bei Depolarisation, ähnlich wie Morphin, eine starke Zunahme in der Effektstärke zeigt. Bei Betrachtung der Veränderungen des Morphin-induzierten, MOR-vermittelten GIRK-Stroms wurde in transfizierten HEK 293T sowohl in Einwärts- als auch in Auswärtsrichtung eine starke Steigerung des Signals detektiert, obwohl für diese Messungen – im Gegensatz zu den FRET-Messungen aufgrund der Kanaleigenschaften nur ein Teil der physiologischen Bandbreite des Membranpotenzials zur Verfügung stand. Es wurde weiterhin versucht, diese, in HEK 293T Zellen bereits auf physiologischer Ebene evident gewordene Spannungsabhängigkeit in einzelnen Neuronen in Schnitten, welche natives LC Gewebe enthielten, nachzuweisen. Obwohl hierbei die, für die Messungen geeignete Bandbreite des Membranpotenzials noch kleiner war, zeigte sich ebenfalls eine signifikante Steigerung der Morphin-induzierten GIRK-Ströme im Vergleich zu peptidergen Liganden. Die vorliegende Arbeit zeigt zusammenfassend die starke, ligandenabhängig unterschiedliche Modulation des MOR, die sich bis hin zu einer veränderten GIRK-Kanal-Aktivierung bemerkbar macht und somit nahelegt, dass depolarisationsinduzierte Rezeptormodulation auch pharmakologische Relevanz besitzt.

Summary:
Recently, in a series of studies it has been proven, that the function of membranous G-protein coupled receptors (GPCR) is modulated by the membrane potential Depending on the type of receptor or ligand, the observed voltage-dependent changes may lead to an enhanced or decreased receptor activity which may be due to a change in affinity and also efficacy. Despite of an increasing number of receptors being characterized, the underlying mechanism of voltage sensitivity remains rather obscure. Also, there is little knowledge about pharmacological implications of voltage sensitivity in native tissue. In the present study the μ-opioid receptor (MOR) has been characterized with regard to voltage sensitivity. As activation of the MOR leads to a decreased propagation of pronociceptive stimuli, the receptor is the most important target for analgesics in treatment of moderate to severe pain. Being expressed in neuronal tissue, the MOR is exposed to robust and high-frequency changes in membrane potential. In the present study voltage sensitivity was elucidated at different levels: in G-protein activation, G-protein coupled receptor kinase 2 (GRK2)- and Arrestin3-recruitment, the voltage sensitivity of the MOR was elucidated on a molecular level by analyzing protein - protein interactions of effectors. To this aim, a setup which allows for the determination of ratiometric Foerster Resonance Energy Transfer (FRET) measurements between fluorescently labelled fusion proteins upon manipulation of the membrane potential by whole cell voltage clamp was used. A further set of experiments, which measured alterations of G-protein activated inwardly rectifying K+ (GIRK) currents, allowed for investigation of the pharmacological consequences of voltage sensitivity. To this aim, MOR-evoked GIRK currents were characterized upon depolarization both in inward and outward direction in transfected HEK 293T cells. Moreover, these currents were also determined in neurons that contained preparations of Locus Coeruleus (LC) neurons2. On a molecular basis, a strong voltage dependent increase in morphine-mediated receptor activation was observed on all investigated levels of signaling. The most striking impacts of voltage on signaling were found in the GRK2- and Arrestin3-recruitment to the morphine-activated MOR. According to previous publications, morphine has been characterized to be a ligand with low intrinsic efficacy, causing only minor recruitment of GRK2 and Arrestin3 in non-depolarized cells to the receptor, when compared with the peptidergic ligands DAMGO or Met-enkephaline. However, upon depolarization to different membrane potentials within the physiological range, a remarkable increase of the initial recruitment was observed and the occurring changes could be identified to demonstrate a change in efficacy. In contrast, investigation of voltage sensitive modulations of the DAMGO-activated receptor showed only minor changes in all observed interactions and the Met-enkephaline activated receptor even exhibited no detectable voltage sensitivity. In a subset of experiments, voltage sensitivity of fentanyl and buprenorphine, two further opioids of therapeutic relevance were tested. While the morphine-like substance buprenorphine showed – similar to morphine – a strong increase in efficacy upon depolarization, for fentanyl which is a structurally different type of ligand, a decrease of MOR-activity was observed upon depolarization. Characterization of changes in morphine-induced MOR-mediated GIRK currents due to depolarization in transfected HEK 293T cells showed an increase of currents both in outward and inward direction, although in these measurements only a small range of potentials within the physiological range of membrane potentials was suited for characterization, due to the physiologic properties of these channels. In a further set of experiments, the investigation of voltage sensitive effects on morphine-mediated GIRK currents in native tissue was performed. In these experiments, slices containing LC neurons were used for measurements. Although measurements in this delicate tissue allow for measurements in an even smaller range of membrane potentials, a significant increase in morphine-mediated GIRK currents, as compared to DAMGO- or Met-enkephaline-mediated currents was observed upon depolarization. In summary, this work demonstrates the strong voltage dependent modulation of MOR-signaling, which occurs to different extents and qualities dependent on the ligand applied. In case of the strong voltage sensitivity of the morphine-activated receptor, these changes become evident even on the level of GIRK currents in physiological tissue suggesting pharmacological relevance of voltage induced alterations of MOR activity.


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