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Titel:Novel lipoparticles for the synergistic chemo-photodynamic therapy of the cancer cells
Autor:Ali, Sajid
Weitere Beteiligte: Bakowsky, Udo (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2020
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2020/0093
DOI: https://doi.org/10.17192/z2020.0093
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2020-00935
DDC:615 Pharmacology & therapeutics, prescription drugs
Titel(trans.):Neue Lipopartikel für die synergistische chemophotodynamische Therapie der Krebszellen
Publikationsdatum:2020-10-14
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Lipopartikel, Photodynamische Therapie, Komet Assay, Rasterkraftmikroskopie, Lipoparticles, Kryo-TEM, Temoporfin, Atomic Force Microscopy.Chorioallantoic Membrane, PLGA Nanopartic, Chorioallantois-Membran, Temoporfin, PLGA-, Comet Assay, Pirarubicin, Cryo-TEM, Photodynamic therapy, Pirarubicin

Summary:
The main theme of the present work was the development of a novel nanocarrier system that can deliver two different therapeutics modalities to the cancer cells. Such a nanocarrier is superior to conventional drug delivery system as it combines two different approaches (i.e. chemotherapy and photodynamic therapy) within one carrier system to treat the cancer. In this work, we were interested in lipid enveloped biodegradable nanoparticles termed as lipoparticles in which two hydrophobic drugs could be encapsulated in separate compartments, a chemotherapeutic agent (Pirarubicin, THP) in the nanoparticle core and a photosensitizer (Temoporfin, mTHPC) in the lipid bilayer shell. Such a system not only increases the therapeutic efficacy, circulating time and bioavailability of the drugs but also reduce the drug leakage and side effects to the other body tissues. In the introduction part of the thesis deals with back ground of the basic principles and detailed mechanism of the photodynamic therapy. The ideal properties of the photosensitizers were discussed. This was followed by a brief insight into the nanocarriers including the liposomes, polymeric nanoparticles and lipid-polymer hybrid nanoparticles. Different methods to prepare the lipoparticles have also been discussed. The methodology section of the thesis deals with the preparation of mTHPC loaded liposomes, THP loaded nanoparticles and consequently the lipid enveloped polymeric nanoparticles. The formed nanoformulations were then evaluated in terms of physicochemical characterizations, in vitro, in ovo, in vivo as well as the biocompatibility studies. In results section, the encapsulation of mTHPC, a potent 2nd generation PS in the liposomes was discussed. For this purpose, a broad range of lipid combination was explored. The physicochemical characterizations including size distribution, zeta potential and encapsulation efficiency was performed. Surface morphological studies using the at atomic force microscopy and cryogenic transmission electron microscopy was conducted. The results obtained from these studies were found to be in accordance with the previous results obtained from the zeta sizer measurement. Further investigations including quantitative assessment of the reactive oxygen species and cellular photodynamic therapy at different wavelengths and different light doses have been discussed. In order to minimize the unethical use of the animals, chick chorioallantoic membrane model (in ovo) as an alternative in vivo model was elaborated for the vascular targeted photodynamic therapy. The intracellular uptake studies using confocal laser scanning microscopy was performed and an effective cellular uptake in the perinuclear region have been shown. 92 In the next chapter of the results, the encapsulation of THP loaded PLGA nanoparticles have been discussed. Two different size of nanoparticles (200nm and 400nm) were prepared in order to have a comparative evaluation of the nanoparticles size, polydispersity index as well as the cell viability using dynamic light scattering and MTT assay respectively. In vitro drug release in simulated conditions revealed a biphasic drug release pattern with initial burst release phase followed by the sustained released pattern for the following days. The THP nanoparticles with smaller size (200nm) showed a higher drug release as compared to 400nm THP NP which was attributed to the larger available surface area for drug diffusion in the earlier case. Further in the results section, the preparation of the lipoparticles have been discussed. Based on the preliminary studies, two best performing liposomes DPPC/mPEG-DPPE5000 and DPPC/DPPG were combined to form a single liposome i.e. DPPC/DPPG/mPEG-DPPE5000 and was coated over the 200nm THP nanoparticles. The formed lipoparticles were also subjected to physicochemical characterizations. An increase in the lipoparticles size of 4-5 nm as compared to uncoated nanoparticles was perceived which was also confirmed with the surface morphological studies using AFM and TEM. The determination higher therapeutic efficacy of the lipoparticles by in vitro cytotoxicity synergism and ROS assay has also been described. The lipoparticles did not show any genotoxicity has been elaborated using single cell gel electrophoresis (comet assay). The stability of the lipoparticles was established in simulated physiological conditions (60% serum & PBS 7.4) and small reduction in particles size owing to the presence of protein corona was demonstrated. Biocompatibility studies were also performed to validate the compatibility of the lipoparticles with the blood components. Hemolysis assay, activated partial thromboplastin time and erythrocyte aggregation assay confirmed the non-toxic and biocompatible nature of the lipoparticles. After the evidencing the biocompatibility of the lipoparticles, the acute in vivo toxicity assessment was performed using BALB/c mice. No significant changes in the body visceral index and serum biomarkers was observed. Also, no significant changes in the tissue histopathology was observed. On the basis of all of these finding, it can be concluded that development of such a novel nanocarrier system can be employed for simultaneous delivery of the multiple drugs to the cancer cells with minimum toxicity. Future pharmacokinetic profiling with in vivo biodistribution and in vivo tumor models with targeting ligands (e.g. antibodies, aptamer etc.) attached on the lipoparticles can serve as a critical link for the pre-clinical studies.

Zusammenfassung:
Das Hauptthema der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines neuartigen Nanocarrier-systems, das zwei verschiedene Therapieansätze zur Krebsbehandlung vereint. Ein solcher Nanocarrier ist dem herkömmlichen Drug Delivery System überlegen, da er verschiedene Ansätze (z.B. Chemotherapie und photodynamische Therapie) innerhalb eines Trägersystems kombiniert. In dieser Arbeit lag der Fokus auf Lipid umhüllte, biologisch abbaubare Nanopartikel, die als „Lipopartikel“ bezeichnet werden. Hierbei ist es möglich, zwei hydrophobe Arzneistoffe in getrennten Bereichen des Trägersystems zu verkapseln: ein Chemotherapeutikum (Pirarubicin, THP) im Nanopartikelkern und ein photoaktiver Stoff (Temoporfin, mTHPC) in der Lipid-Doppelschicht. Ein solches System erhöht nicht nur die therapeutische Wirksamkeit, die Blutzirkulationszeit und die Bioverfügbarkeit der Arzneimittel, sondern reduziert auch den frühzeitigen Austritt des Arzneistoffes sowie Nebenwirkungen auf andere Gewebe. In der Einleitung der Arbeit werden die Grundprinzipien und der detaillierte Mechanismus der photodynamischen Therapie dargestellt. Das Eigenschaftenprofil wie auch deren Optimierung solcher photoaktiven Stoffe, der sogenannten „Photosensitizer“, standen hier im Vordergrund der Diskussion. Im Anschluss erfolgte eine systematische Präsentation nanoskaliger „drug delivery“ Systeme, einschließlich Liposomen, polymerer Nanopartikel und Lipid-Polymer-Hybrid-Nanopartikel. Verschiedene Methoden zur Herstellung der modernen Lipopartikel wurden ebenfalls dargestellt und diskutiert. Der experimentelle Teil der Dissertation umfasst die Herstellung mTHPC-beladener Liposomen, THP-beladener Nanopartikel und Lipid umhüllter Polymernanopartikel. Die Charakterisierung der hergestellten parenteralen Formulierungen erfolgte mit Hilfe von physikalisch-chemischen Methoden, in vitro, in ovo, in vivo sowie mit toxikologischen Biokompatibilitätsstudien. Der Ergebnisteil beschreibt ausführlich die verwendeten Methoden und Analyse der Verkapselung von mTHPC, dem verwendeten potenten Photosensitizer der 2. Generation, in Liposomen. Zu diesem Zweck wurde ein breites Spektrum an Lipidkombinationen getestet und mit physikalisch-chemischen Methoden einschließlich Größenverteilung, Zetapotenzial sowie deren Verkapselungseffizienz untersucht. Durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Gefrier-Transmissionselektronenmikroskopie konnte die Teilchengröße wie auch deren Oberflächenmorphologie analysiert werden. Die Ergebnisse dieser Studien bestätigten die Ergebnisse der PCS-Messungen. Weitere Untersuchungen wie die quantitative Bewertung der während der biologischen Untersuchungen entstandenen reaktiven Sauerstoffspezies sowie die Wirkung der in Zellkultur durchgeführten photodynamischen Therapie, bei verschiedenen Wellenlängen und Lichtstärken, wurden diskutiert. Um die unethische Nutzung von Versuchstieren zu minimieren, erfolgte die Untersuchung der gezielten antivaskulären (antiangiogenese Therapie) photodynamischen Therapie an dem chorioallantoischen Membranmodell (CAM, in ovo), das eine Alternative zum in vivo Modell darstellt. Die Aufnahme der Wirkstoffträger in die Zellen erfolgte mit Hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und verdeutlichte eine effektive zelluläre Aufnahme in den perinukleären Bereich. 94 Das folgende Kapitel des Ergebnisteils beschäftigt sich mit der Verkapselung von THP in PLGA-Nanopartikel. Zwei verschiedene Größen von Nanopartikeln (200nm und 400nm) wurden hergestellt, um eine vergleichende Bewertung der Größe der Nanopartikel und des Polydispersitätsindex auf das Zellüberleben zu erhalten. Diese Daten konnten mittels dynamischer Lichtstreuung bzw. MTT-Assay erhalten werden. Die in vitro Freisetzung des Arzneistoffes unter simulierten Bedingungen ergab ein zweiphasiges Freisetzungsprofiel, mit einer anfänglichen Burst-Freisetzungsphase, gefolgt von einer über die folgenden Tage anhaltenden kontinuierlichen Freisetzung. Die THP-Nanopartikel mit geringerer Größe (200 nm) zeigten dabei eine höhere Wirkstofffreisetzung pro Zeiteinheit im Vergleich zu 400 nm großen THP Nanopartikeln, was als eine Folge der größeren verfügbaren Oberfläche für die Wirkstoffdiffusion diskutiert werden kann. Basierend auf den Voruntersuchungen wurden im nächsten Kapitel die beiden leistungsstärksten Liposomen zu einem einzigen Liposom mit der Zusammensetzung DPPC/DPPG/mPEG-DPPE5000 kombiniert. Diese Liposomen sind anschließend zur Beschichtung der 200nm großen THP-Nanopartikel verwendet worden. Diese wurden eingehend physikalisch-chemisch charakterisiert. Die Lipopartikelgröße nimmt um etwa 4-5 nm im Vergleich zu unbeschichteten Nanopartikeln zu, was auch die oberflächenmorphologischen Studien mit AFM und TEM bestätigten. Die Bestimmung der höheren therapeutischen Wirksamkeit der Lipopartikel durch Zytotoxizitätsstudien wurde in vitro betätigt. Der Nachweis der erhöhten Produktion reaktiver Sauerstoffspezies erfolgte ebenfalls. Die Einzelzellgelelektrophorese (Comet-Assay) gab keinerlei Hinweise auf eine Genotoxizität der Lipopartikel. Die Untersuchung der Stabilität der Lipopartikel fand unter simulierten physiologischen Bedingungen (60% Serum, PBS 7,4) statt und zeigte eine geringe Vergrößerung des Partikeldurchmessers durch das Vorhandensein einer Proteinkorona. Durch Biokompatibilitätsstudien war es möglich, die Verträglichkeit der Lipopartikel mit Blutkomponenten zu validieren. Die Bestimmung der aktivierten Teilthromboplastinzeit und Erythrozytenaggregationstests bestätigten die Verträglichkeit und Biokompatibilität der Lipopartikel. Anschließend konnte die in vivo Toxizität der Lipidpartikel an BALB/c-Mäusen stattfinden. Es wurden keine signifikanten Veränderungen im viszeralen Index der Mäuse und in den Serum-Biomarkern beobachtet. Die Gewebehistopathologie zeigte ebenfalls keine signifikanten Veränderungen. Auf der Grundlage all dieser Ergebnisse kann der Schluss gezogen werden, dass es möglich ist, solche neuartigen Nanocarriersystems für die gleichzeitige Abgabe verschiedener Arzneistoffe an Krebszellen mit minimaler Toxizität prinzipiell einzusetzen. Die zukünftige Erstellung des pharmakokinetischen Profils einschließlich der in vivo Biodistribution und die Überprüfung der Effektivität der Lipopartikel an in vivo Tumormodellen können als kritisches Bindeglied für präklinische Studien dienen. Auch durch eine Kopplung von Liganden (z.B. Antikörpern, Aptameren etc.) kann eine weitere Steigerung der Effizienz erreicht werden.


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