Zusammenfassung:
Eine wichtige Gruppe pflanzlicher Inhaltsstoffe sind phenolische Verbindungen, zu denen Hydroxyzimtsäureester wie Rosmarinsäure, Chlorogensäure, aber auch Zichoriensäure und die Cimicifugasäuren zählen. Die Biosynthese dieser Hydroxyzimtsäureester wird durch Hydroxycinnamoyltransferasen aus der BAHD-Superfamilie katalysiert.
Zichoriensäure wurde zuerst in der Zichorie, Cichorium intybus L. (Asteraceae), entdeckt. Es handelt sich um Dicaffeoylweinsäure. Bisherige Untersuchungen mit Proteinrohextrakten aus Ackerschachtelhalm (Equisetum arvense L., Equisetaceae) und einer Erdnuss-Art (Arachis glabrata L., Fabaceae) zeigten, dass die Bildung der Zichoriensäure durch Reaktion von Weinsäure mit Caffeoyl-CoA zunächst zur Bildung von Kaftarsäure führt, die dann durch Anlagerung einer weiteren Kaffeesäure zu Zichoriensäure umgesetzt wird. Das daran beteiligte Enzym konnte jedoch noch nicht isoliert werden. Auch Basilikum (Ocimum basilicum L., Lamiaceae) enthält, neben Rosmarinsäure, Zichoriensäure. Die in dieser Arbeit untersuchten Proteinrohextrakte führten unter Verwendung von m-, L- und D-Weinsäure mit Caffeoyl-CoA zu keiner Bildung von Zichoriensäure. Die von uns angelegten Zellkulturen enthielten Rosmarin-säure, jedoch keine nachweisbare Menge Zichoriensäure. Eine Elicitierung über bis zu 96 h mit 100 µM Methyljasmonat führte nicht zur Bildung von Zichoriensäure, jedoch stieg der Rosmarinsäuregehalt von anfangs 2,6 % auf 5,3 % im Trockengewicht. Eine Zufütterung von Weinsäure zu den Suspensionskulturen des Basilikums konnte die Zichoriensäure-Biosynthese nicht induzieren. Untersuchungen von Zellkulturen der Zichorie zeigten ebenfalls kein Vorhandensein der Zichoriensäure. Weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet sind nötig, da die Biosynthese der Zichoriensäure und die beteiligten Enzyme noch immer nicht bekannt sind.
Cimicifugasäuren erhielten ihren Namen von Cimicifuga racemosa (L.) NUTT., heute Actaea racemosa L., der Traubensilberkerze. Diese mehrjährige, ein ausgeprägtes Rhizom ausbildende Art der Ranunculaceae findet Verwendung in der Therapie von peri- und postmenopausalen Beschwerden. Die biologische Wirkung und die Biosynthese der Inhaltsstoffe der Traubensilberkerze sind bisher nicht aufgeklärt.
Eine bis dato nicht charakterisierte Nukleotidsequenz aus der Traubensilberkerze, welche eine hohe Sequenzähnlichkeit zu anderen Enzymen der BAHD-Enzymfamilie aufweist, konnte erfolgreich amplifiziert (ArCAS) und in E. coli-Zellen exprimiert werden. Das aufgereinigte Protein hat eine Größe von 50 kDa. Zur Testung auf Aktivität wurden zunächst die erforderlichen (Hydroxy)Cinnamoyl-CoA-Ester synthetisiert und Piscidinsäure aus einem Extrakt aus Quillaja saponaria isoliert. Tests des Enzyms mit Piscidinsäure und p-Cumaroyl-, Caffeoyl-, Sinapoyl- und Feruloyl-CoA führten zur Bildung der entsprechenden Cimicifugasäuren. Die Charakterisierung des Enzyms unter vorher bestimmten optimalen Bedingungen zeigte, dass p Cumaroyl CoA mit einem Km-Wert von 6,8 ± 2,3 µM das am besten akzeptierte Substrat ist.
Ein reverser Enzymtest mit Fukinolsäure und Coenzym A als Substraten zeigt die Bildung von Fukinsäure. Dies ist ein erster Hinweis auf die Akzeptanz der Fukinsäure durch die ArCAS, da Fukinsäure für Tests nicht zur Verfügung stand.
Das Anlegen von Zellkulturen aus Frischmaterial und Samen der Traubensilberkerze war bisher nicht erfolgreich, doch stellen Zellkulturen eine wichtige Grundlage für weitere Untersuchungen der Expression der ArCAS dar. Zudem ist die Biosynthese der Piscidin- und Fukinsäure bislang nicht untersucht, so dass auch in diesem Fall die Zellkulturen verwendet werden könnten.
Eine phylogenetische Untersuchung ergab eine Verwandtschaft der ArCAS mit einer Spermidin Hydroxycinnamoyltransferase aus Malus domestica Borkh., einer Äpfelsäure Hydroxycinnamoyltransferase aus Trifolium pratense L. und einer Tetrahydroxyhexandisäure Hydroxycinnamoyltransferase aus Phaseolus vulgaris L.. Trotz dieser phylogenetischen Nähe wurde keines der Substrate dieser Enzyme durch die ArCAS akzeptiert. Auch die Substrate anderer Hydroxycinnamoyltransferasen wie p-Hydroxyphenylmilchsäure, Chinasäure, Shikimisäure und verschiedene Aminosäuren wurden getestet, jedoch nicht durch das Enzym akzeptiert. Daraus lässt sich ableiten, dass ArCAS eine hohe Spezifität für die Bildung von Cimicifugasäuren hat.
Blüten, Blätter und Wurzeln von Actaea racemosa wurden extrahiert und der Gehalt an Polyphenolen mittels Folin-Ciocalteu-Reagenz bestimmt. Den höchsten Gehalt an Polyphenolen wiesen die Blätter auf, den niedrigsten hingegen die Wurzeln. Weitere Untersuchungen der Extrakte zeigten, dass die Mengen an Cimicifugasäuren variieren. Ebenso unterscheidet sich die Verteilung der Cimicifugasäuren innerhalb der Pflanze, überdies sind nicht alle der bekannten Cimicifugasäuren nachweisbar.
Die ArCAS ist das Hauptenzym der Cimicifugasäure-Biosynthese aus CoA-aktivierten Hydroxyzimtsäuren und Piscidinsäure. Durch die hier präsentierten Untersuchungen ist erstmalig ein Schritt der Bildung von Cimicifugasäuren in Actaea racemosa aufgeklärt worden.