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Titel: Targeted optimization of chromatographic columns based on 3D analysis of packing microstructure
Autor: Reising, Arved Ernst
Weitere Beteiligte: Tallarek, Ulrich (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-07115
DDC: Chemie
Titel(trans.): Gezielte Optimierung chromatographischer Säulen auf der Basis von 3D-Analyse ihrer Packungsmikrostruktur
Publikationsdatum: 2017-11-14


Rekonstruktion, FIB-SEM, Konfokale Mikroskopie, HPLC, Strukturanalyse, reconstruction, FIB-SEM, CLSM, HPLC, structure analysis

The preparation, structure, and performance of functional materials porous are strongly interrelated. Hence, a detailed analysis of the pore structure of a functional porous material in combination with a detailed characterisation of its performance can provide an understanding of the influence of individual parameters during preparation and thus identify structural limitations to an improved utilization. The obtained results can be used to tune the preparation towards a better pore structure suited for the targeted application. This work focuses on packings of silica-based particles for highly efficient chromatographic separations. The prepared packings combine an interparticle macropore space for fast flow-based transport with an intraparticle mesopore space providing high surface areas for molecule-surface interactions. Such packed columns have a wide field of application, not only in highly efficient separations, but also for catalysis, and (energy) storage However, the focus here is on separations in liquid chromatography. In Chapter 1, the influence of the slurry concentration on separation efficiency and bed structure was investigated for capillary columns (75 µm inner diameter, 30 cm length) packed with 1.3 µm bridged-ethyl hybrid (BEH) fully porous silica particles. The slurry concentration was varied from 5 to 50 mg/mL while every other packing parameter was kept constant. Chromatographic characterisation with hydroquinone as weakly retained analyte revealed highly efficient separations (reduced plate heights as low as 1.5) at an optimal intermediate slurry concentration of 20 mg/mL for this specific set of packing parameters. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) was utilized to conduct a three-dimensional reconstruction and to carry out a detailed morphological analysis of the column with the best performance, a column packed with a slurry concentration below the optimum, and one packed above the optimum. Two counteracting effects were revealed: Radial heterogeneities limit the separation efficiency for columns packed at low slurry concentrations. With an increase in slurry concentration, these radial effects get supressed but the number and size of large voids with a diameter similar to the mean particle diameter increase significantly. Interestingly, the reconstructions also revealed high external bed porosities between 0.47 and 0.50 which are higher than expected with respect to the random loose packing limit reported for frictional, cohesionless particles. However, no signs of bed instability could be observed demonstrating the significant impact of interparticle forces for particles as small as 1.3 µm. In Chapter 2, the investigation of the optimal slurry concentration was expanded by analysing the effects for a different particle size to obtain a more general picture. A similar set of capillary columns (75 µm inner diameter, 45 cm length) was packed with 1.9 µm BEH particles at eleven different slurry concentrations between 5 and 200 mg/mL including additional tests for reproducibility at selected concentrations and the observation of bed formation using optical microscopy. While comparable reduced plate heights were achieved, the observed optimum of 140-160 mg/mL to pack highly efficient columns reproducibly differed significantly from the 20 mg/mL for the 1.3 µm particles identified in Chapter 1. This can be explained by the difference in the particle diameter as interparticle forces and particle aggregation become more dominant at still smaller diameters. CLSM-based reconstructions revealed similar trends in the bed structures as seen in Chapter 1. At low concentrations, pronounced ordered particle layers in the direct vicinity of the column wall, local bed densification near the column wall, and particle size-segregation limit the achieved separation efficiency. The peculiarity of the first effect is continuously decreasing with an increase in the slurry concentration even beyond the optimum while the latter two effects are already supressed at the optimal slurry concentration. On the other hand, the number and size of large voids increase with an increase in the utilized slurry concentration as already seen in Chapter 1. The videos acquired during column packing provided very helpful insights into bed formation mechanisms and thus delivered possible explanations for these structural features. At 10 mg/mL, particles arrive individually at the bed front allowing individual settlement and rearrangement on the arrival of following particles what allows a discrimination of particles according to their individual properties. The picture looks completely different for 100 mg/mL as example for higher concentrated slurries. Here, particles tend to aggregate during packing and arrive in large batches. This prevents discrimination of individual particles but significantly reduces the chances for rearrangement and is thus prone to the conservation of defects formed between the border of the arriving batches of particles and the front of the bed. Chapter 3 is based on the results obtained during the work presented in Chapters 1 and 2. The combination of high slurry concentration and ultrasound was already proposed there as chance to keep transcolumn heterogeneities as low as possible while preventing the formation of large voids. To test this hypothesis, two sets, each consisting of three capillary columns (75 µm inner diameter, 100 cm length) were packed with 1.9 µm BEH particles at a slurry concentration of 200 mg/mL; one set under application of ultrasound during packing, the other one without. All three columns, which underwent sonication, showed significantly better performance than each of the other columns. The obtained reduced minimum plate height for a weakly retained analyte was even lower than the already impressive value of 1.5 for columns packed at a slurry concentration optimal for packing without sonication and reached values close to unity over a length of 1 m for the best-performing column. The achieved theoretical plate counts of ~500,000 demonstrate a unique potential for highly efficient separations of extremely complex samples. In Chapter 4, the focus is shifted from capillary columns to the more common analytical format. CLSM could not be applied here as the steel columns are not transparent and extrusion of the bed is not possible without losing either stability or optical transparency. Thus, an imaging and reconstruction procedure based on focused ion beam scanning electron microscopy was developed using a commercial narrow-bore analytical column (2.1 mm inner diameter, 50 mm length) packed with 1.7 µm BEH particles. The packing was embedded with poly(divinylbenzene) prior to extrusion from the steel column in order to conserve the bed structure. Two image stacks were acquired and reconstructed at characteristic positions within the bed: one in the central section of the column along the flow direction to obtain the bulk properties of the bed and one from the column wall towards the column centre to investigate and quantify the influence of the geometrical wall effect and the second wall effect. To investigate the effect of the microstructure in the wall region on local flow through the bed, a radially resolved flow profile was obtained by lattice-Boltzmann simulations. For this column, the region affected by wall effects spanned over approximately 62 particle diameters showing a decrease in the local mean porosity by up to 10% and an increase in the local mean particle diameter by up to 3% with respect to the bulk region inducing a decrease of the local flow velocity by up to 23%. Furthermore, four more ordered layers of particles were formed directly at the hard column wall due to the geometrical wall effect leading to local velocity fluctuations by up to a factor of three. These quantified structural features are in excellent agreement with previous reports about macroscopic characterisations of the wall effects by optical or chromatographic measurements.

Die Herstellung eines Materials, seine Struktur und seine funktionellen Eigenschaften stehen in einem direkten Zusammenhang miteinander. Daher ist eine detaillierte Analyse der Porenstruktur eines Funktionsmaterials, Hand in Hand mit einer detaillierten anwendungsorientierten Charakterisierung, extrem hilfreich für das Verständnis der Auswirkungen einzelner Präparationsparameter und zur Identifikation von strukturellen Limitierungen in der Anwendung. Eine Betrachtung aller erhaltenen Ergebnisse im Gesamtkontext ermöglicht, den Herstellungsprozess und damit die Porenstruktur gezielt für spezielle Anwendungen zu optimieren. In dieser Arbeit wurden Packungen von siliciumdioxid-basierten Partikeln untersucht, die einen interpartikulären Makroporenraum, der schnellen Stofftransport durch Porenströmung ermöglicht, mit einer hohen intrapartikulären Oberfläche für Wechselwirkungen mit Zielmolekülen kombinieren. Diese haben vielfältige Anwendungen in hocheffizienten Stofftrennungen und Katalyse, sowie der Stoff- und Energiespeicherung. Als spezielle Anwendung stand dabei die Stofftrennung durch Flüssigchromatographie im Vordergrund dieser Arbeit. Im ersten Kapitel wurde dabei der Einfluss der Suspensionskonzentration während des Packprozesses auf die chromatographische Effizienz und die Bettstruktur von Kapillarsäulen (75 µm innerer Durchmesser, 30 cm Länge) am Beispiel von Acquity BEH (bridged ethyl hybrid) Partikeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1.3 µm untersucht. Dazu wurden neun Säulen bei einer schrittweisen Erhöhung der Suspensionskonzentration von 5 mg/mL auf 50 mg/mL gepackt, wobei alle weiteren Packparameter konstant gehalten wurden. Die chromatographische Charakterisierung mit Hydrochinon als schwach retardiertem Analyten zeigte ausgezeichnete Trenneffizienzen, wobei das beste reduzierte Bodenhöhenminimum von 1.5 bei einer mittleren Suspensionskonzentration von 20 mg/mL erhalten wurde. Sowohl höhere als auch niedrige Konzentrationen zeigten signifikant schlechtere Effizienzen. Um die Ursachen für diese unterschiedlichen Trennleistungen zu verstehen, wurden drei der gepackten Säulen für dreidimensionale Rekonstruktionen ihrer Bettstrukturen mittels Konfokal-Lasermikroskopie (CLSM, confocal laser scanning microscopy) ausgewählt: eine Säule repräsentativ für Suspensionskonzentrationen unterhalb des Optimums, die Säule mit der höchsten Trenneffizienz und eine Säule repräsentativ für Suspensionskonzentrationen oberhalb des Optimums. Dabei konnten zwei gegenläufige Effekte identifiziert werden. Bei niedrigen Suspensionskonzentrationen limitieren radiale Heterogenitäten die Trenneffizienz, die bei höheren Konzentrationen zunehmend unterdrückt wurden. Gegenläufig bilden sich allerdings bei zunehmenden Konzentrationen mehr und mehr Hohlräume in der Größe eines typischen Partikels in der Struktur, wobei sowohl deren Größe als auch deren Zahl mit der Suspensionskonzentration zunimmt. Am Optimum wurden diese Effekte am besten ausbalanziert. Ein weiterer interessanter Aspekt dieser Säulen sind ihre hohen interpartikulären Porösitäten zwischen 0.47 und 0.50, die sogar höher sind, als Untersuchungen der Stabilität loser Kugelpackungen erwarten ließen. Der Umstand, dass keinerlei Instabilitäten der Bettstrukturen beobachtet werden konnten, verdeutlicht den signifikanten Einfluss von interpartikulären, stabilisierenden Wechselwirkungen für derartig kleine Partikel. Im zweiten Kapitel wurde die Untersuchung des Einflusses der Suspensionskonzentration vertieft, um ein allgemeineres Bild zu erhalten. Dazu wurde analog zum ersten Kapitel eine weitere Serie von Säulen gepackt, wobei diesmal Acquity BEH Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1.9 µm verwendet wurden. Es wurden elf Säulen (75 µm innerer Durchmesser, 45 cm Länge) mit Suspensionskonzentrationen zwischen 5 und 200 mg/mL gepackt, wobei für ausgewählte Konzentrationen (20 mg/mL, 80 mg/mL, 140 mg/L) die Reproduzierbarkeit des Packprozesses untersucht wurde und zusätzlich Videos während der Ausbildung des Säulenbettes für 10 und 100 mg/mL aufgenommen wurden. Die chromatographische Charakterisierung zeigte vergleichbare minimale reduzierte Bodenhöhen zu den 1.3 µm Partikeln aus Kapitel 1. Allerdings liegt das Optimum für das reproduzierbare Packen hocheffizienter Säulen bei deutlich höheren Suspensionskonzentrationen von 140‒160 mg/mL (im Vergleich zu 20 mg/mL in Kapitel 1). Dies lässt sich durch den signifikanten Größenunterschied zwischen den beiden Partikeltypen erklären, da die interpartikulären Wechselwirkungen mit kleinerem Durchmesser massiv an Einfluss gewinnen. Es wurden ebenfalls CLSM-basierte Rekonstruktionen durchgeführt, die ähnliche strukturelle Trends identifizieren wie in Kapitel 1. Bei niedrigen Suspensionskonzentrationen zeigen sich geordnete Partikellagen direkt an der Säulenwand gefolgt von zufälliger aber verdichteter Packungsstruktur in der Nähe der Säulenwand, sowie eine radiale Diskriminierung der Partikel anhand ihrer Größe. Diese Effekte werden mit zunehmender Konzentration unterdrückt bzw. zunehmend in ihrer Ausprägung reduziert, wobei gegenläufig eine zunehmende Ausbildung von größeren Hohlräumen zu beobachten ist. Die aufgenommenen Videos liefern Anhaltspunkte, wie sich diese Strukturen ausbilden. Bei einer Konzentration von 10 mg/mL erreicht ein kontinuierlicher Strom von einzelnen Partikeln die Front des Packungsbettes, was mehrfaches Umlagern und radiale Diskriminierungen ermöglicht. Ein komplett anderes Bild zeigt sich bei hohen Konzentrationen. Hier erreichen größere Aggregate von Partikeln die Bettfront, was die Chance für spätere Umlagerungen reduziert, aber jegliche Defekte, die sich beim Auftreffen der Aggregate auf die Bettfront bilden, konserviert. Das dritte Kapitel baut auf den Ergebnissen der ersten beiden Kapitel auf, um eine weitere Verbesserung des Packverfahrens zu erreichen. Dort wurde die mögliche Kombination von hohen Suspensionskonzentrationen zur Reduzierung der radialen Heterogenitäten mit dem Einsatz von Ultraschall während des Packprozesses als mögliche Lösung diskutiert. Um diese Hypothese zu testen, wurden zwei Sets von je drei Säulen (75 µm innerer Durchmesser, 100 cm Länge) mit 1.9 µm Acquity BEH Partikeln bei einer Suspensionskonzentration von 200 mg/mL gepackt, wobei für ein Set nach dem gleichen Protokoll wie in Kapitel 2 gearbeitet wurde und für das andere Set zusätzlich Ultraschall eingesetzt wurde. Jede der Säulen, die mit Hilfe von Ultraschall gepackt wurde, zeigte eine signifikant bessere Trenneffizienz als jede der Säulen, die ohne Ultraschall gepackt wurden. Dabei wurden für schwach retardierte Analyten minimale reduzierte Bodenerhöhen von nahe 1 erreicht, welche sogar die bereits sehr guten Werte von 1.5 für optimale Packprotokolle ohne Ultraschall in den Kapiteln 1 und 2 deutlich übertreffen. Damit zeigen die Säulen mit einer Bodenzahl von ca. 500.000 ein großes Potential für die hocheffiziente Trennung von sehr komplexen Proben. Im vierten Kapitel wird der Fokus von Kapillarsäulen auf das deutlich weiter verbreitete analytische Format verlagert. In diesem kann CLSM nicht auf gepackte Säulenbetten angewendet werden, da die Säulengehäuse (gewöhnlich aus Edelstahl) nicht optisch transparent sind und bei einem Extrudieren des Bettes nicht gleichzeitig Struktur und optische Transparenz gewahrt werden können. Daher wurde auf der Basis von fokussiertem Ionenstrahl in Kopplung mit Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM, focused ion beam scanning electron microscopy) ein Abbildungs- und Rekonstruktionsverfahren anhand einer exemplarisch ausgewählten, kommerziellen narrow-bore Säule entwickelt (2.1 mm innerer Durchmesser, 5 cm Länge, 1.9 µm Acquity BEH Partikel). Vorbereitend wurde das gepackte Bett durch das Einbetten in Polydivinylbenzol stabilisiert und anschließend aus der Säule extrudiert. Zwei Bereiche wurden vermessen und rekonstruiert: ein Abschnitt im Bulkbereich der Säule entlang der Flussrichtung zur Untersuchung der Bulkeigenschaften und ein Abschnitt von der Säulenwand in Richtung der Säulenmitte, um die strukturellen Eigenschaften des geometrischen Wandeffektes und des sogenannten zweiten Wandeffektes zu charakterisieren und zu quantifizieren. Weiterhin wurden die Auswirkungen der Mikrostruktur in der Wandregion auf den Fluss durch die Säule mittels Simulationen unter Anwendung der lattice-Boltzmann Methode untersucht. Die Rekonstruktionen zeigen signifikante Unterschiede der Packungsstruktur in der Wandregion im Vergleich zur Bulkregion mit einer Ausdehnung von ca. 62 Partikeldurchmessern. Dabei ist die mittlere Porösität lokal um bis zu 10% reduziert und gleichzeitig der mittlere Partikeldurchmesser um bis zu 3% erhöht, was zusammen zu einer Reduktion der lokalen Fließgeschwindigkeit um bis zu 23% führt. Außerdem bilden sich durch den geometrischen Wandeffekt vier Partikellagen mit höherer Ordnung direkt an der Säulenwand aus, was zu lokalen Oszillationen der Fließgeschwindigkeit bis zu einem Faktor von drei führt. Diese Quantifizierungen einzelner Struktur- und Dynamikeffekte sind in exzellenter Übereinstimmung mit Arbeiten, welche die Wandeffekte durch makroskopische optische Messungen oder traditionelle chromatographische Messungen studiert haben.

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