Zusammenfassung:
Das Bodenbakterium B. subtilis ist in seinem Habitat starken Schwankungen hinsichtlich Osmolaritäten und Wasserhaushalt ausgesetzt. B. subtilis ist in der Lage sich an hochosmolare Wachstumsbedingungen durch die Neusynthese oder die Aufnahme der osmoprotektiven Aminosäure Prolin anzupassen. Die Prolinbiosynthese in B. subtilis kann über zwei Wege realisiert werden. Der anabole ProB-ProA-ProI-Weg wird zur Prolinproduktion für die Proteinbiosynthese genutzt. Der osmoadaptive ProJ-ProA-ProH-Weg dient der Bereitstellung großer Prolinmengen für den Einsatz als Osmostress-Schutzsubstanz. Die γ-Glutamylkinasen ProB und ProJ sind Isoenzyme, welche den jeweils ersten Schritt der beiden Prolinbiosynthesewege katalysieren. Sie unterscheiden sich maßgeblich hinsichtlich ihrer Regulation. Die Expression des proBA-Operons wird in Anpassung an die intrazelluläre Prolinkonzentration durch ein T-Box-regulatorisches System kontrolliert. Die Expression des proHJ-Genclusters steht hingegen unter osmotischer Kontrolle und wird durch den Anstieg der externen Osmolarität induziert. Auf Proteinebene wird das anabole ProB-Enzym durch Prolin allosterisch Feedback-reguliert. Das osmoadaptive ProJ-Enzym unterliegt scheinbar keiner solchen posttranskriptionellen Regulation.
Die Feedback-Inhibition wird durch einen 16 Aminosäuren langen flexiblen Loop im aktiven Zentrum der γ-Glutamyl-Kinase moduliert. Die γ-Glutamyl-Kinasen ProB und ProJ zeigen hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz einen signifikanten Unterschied in diesem Loop. Das durch Prolin Feedback-inhibierte Enzym ProB aus B. subtilis weißt einen negativen Glutamat-Rest an der Aminosäure-Position 142 im flexiblen Loop auf, während das ProJ-Protein einen positiv geladenen Arginin-Rest an der entsprechenden Position zeigt. Mit Hilfe bioinformatischer Analysen konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die negative Aminosäure Glutamat in Enzymen des ProB-Typs und die positive Aminosäure Arginin in Enzymen des ProJ-Typ innerhalb der Gattung Bacillus hochkonserviert sind. Auf Grundlage dieser bioinformatischen Analysen wurden B. subtilis-Mutanten konstruiert, bei denen die negative Aminosäure Glutamat im anabolen ProB gegen die positive Aminosäure Arginin (E142R) ausgetauscht wurde. Umgekehrt wurde im osmoadaptiven ProJ-Enzym Arginin gegen Glutamat ausgetauscht. Die Aminosäuresubstitution in ProB führt zu einer verminderten allosterischen Regulation des Proteins, welche mit einer erhöhten Prolinakkumulation in vivo sowie einer gesteigerten osmotischen Toleranz einhergeht. Der Austausch in ProJ führt hingegen zu einer erhöhten allosterischen Regulation und bewirkt eine verminderte Prolinakkumulation sowie eine geringere osmotische Toleranz. Die gezeigten Daten beweisen, dass die γ-Glutamyl-Kinasen ProB und ProJ aufgrund ihrer unterschiedlichen allosterischen Regulation bestens auf ihre physiologische Funktion im anabolen oder osmoadaptiven Prolinbiosyntheseweg in B. subtilis abgestimmt sind.
Die anabole und die osmoadaptive Prolinbiosynthese in B. subtilis sind über das gemeinsam genutzte Enzym ProA miteinander verknüpft. Da kein paraloges Enzym existiert, führt die Deletion von ProA zu einer massiven Reduktion der Prolinbiosynthese. Die vorliegende Arbeit zeigt Suppressormutanten, die in der Lage sind über die Rekrutierung von Enzymen des Argininstoffwechsels sowohl die anabole als auch die osmoprotektive Prolinbiosynthese aufrecht zu erhalten. Zwei Klassen von Mutationen konnten identifiziert werden: Zum einen Mutationen in der Promotorregion von des argC-Operons, welches für Gene der Argininsynthese kodiert. Zum anderen Mutationen im Regulatorprotein AhrC, welches als Repressor für die Transkription des argC-Operons fungiert. Beide Klassen von Mutationen führen zu einer verschlechterten Bindung des Transkriptionsrepressors AhrC an seine Operatorregion im Promotorbereich des argC-Operons und folglich zu einer erhöhten Expression des argC-Operons und zu größeren Ornithin-Pools in der Zelle. B. subtilis ist dazu in der Lage ausgehend von Ornithin mittels RocD, einem Enzym des Arginin-Katabolismus, dasselbe Produkt wie ProA zu bilden und kann folglich dessen Fehlen ersetzen. Desweiteren liefert die vorliegende Arbeit erste Hinweise darauf, dass die Aminosäure Arginin unter bestimmten Voraussetzungen ebenfalls als osmotische Schutzsubstanz von B. subtilis genutzt werden kann. Die gezeigten Untersuchungen demonstrieren die Fähigkeit von Bakterien sich flexibel an Beeinträchtigungen essentieller Stoffwechselwege anzupassen.
Bibliographie / References
- Hu CA, Delauney AJ, Verma DP. 1992. A bifunctional enzyme (∆1-pyrroline-5-carboxylate synthetase) catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9354-9358.
- Bremer, E. 2002. Adaptation to changing osmolarity, pp. 385-391. In Sonenshein AL, et al. (eds), Bacillus subtilis and its closest relatives, ASM Press, Washington, DC.
- Condon C, Grunberg-Manago M, Putzer H. 1996. Aminoacyl-tRNA synthetase gene regulation in Bacillus subtilis. Biochimie 78:381-389.
- Street TO, Bolen DW, Rose GD. 2006. A molecular mechanism for osmolyte-induced protein stability.
- Chopin A, Biaudet V, Ehrlich SD. 1998. Analysis of the Bacillus subtilis genome sequence reveals nine new T-box leaders. Mol. Microbiol. 29:662-664.
- Henkin TM, Glass BL, Grundy FJ. 1992. Analysis of the Bacillus subtilis tyrS gene: conservation of a regulatory sequence in multiple tRNA synthetase genes. J. Bacteriol. 174:1299-1306.
- Bradford, MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254.
- Bligh EG, Dyer WJ. 1959. A rapid method of lipid extraction and purification. Can. J. Biochem.
- Blount P, Moe PC. 1999. Bacterial mechanosensitive channels: integrating physiology, structure and function. Trends Microbiol. 7:420-424.
- Booth IR. 2014. Bacterial mechanosensitive channels: progress towards an understanding of their roles in cell physiology. Curr. Opin. Microbiol. 18:16-22.
- Belitsky BR. 2002. Biosynthesis of amino acids of the glutamate and aspartate families, alanine, and polyamines, pp. 203-231. In Sonenshein AL, Hoch JA, Losick R (eds), Bacillus subtilis and its closest relatives: from genes to cells, ASM Press, Washington, DC.
- Baumberg S, Klingel U. 1993. Biosynthesis of arginine, proline and related compounds, pp. 299-306.
- Baumberg S, Harwood CR. 1979. Carbon and nitrogen repression of arginine catabolic enzymes in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 137:189-196.
- Batiza AF, Rayment I, Kung C. 1999. Channel gate! Tension, leak and disclosure. Structure 7:R99 - R103.
- Helfert C, Gotsche S, Dahl MK. 1995. Cleavage of trehalose-phosphate in Bacillus subtilis is catalyzed by a phospho-α-(1-1)-glucosidase encoded by the treA gene. Mol. Microbiol. 16:111-20.
- Cohen GN, Rickenberg RH. 1956. Concentration specifique reversible des amino acides chez E. coli.
- Chang AC, Cohen SN. 1978. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol. 134:1141-1156.
- Bremer E, Kraemer R. 2000. Coping with osmotic challenges: osmoregulation through accumulation and release of compatible solutes, pp. 79-97. In Storz G, Hengge-Aronis R (eds), Bacterial stress response, ASM Press, Washington, DC.
- Corrigan RM, Grundling A. 2013. Cyclic di-AMP: another second messenger enters the fray. Nat.
- Potts M. 1994. Desiccation tolerance of prokaryotes. Microbiol. Rev. 58:755-805.
- Chen M, Cao J, Zheng C, Liu Q. 2006. Directed evolution of an artificial bifunctional enzyme, gamma-glutamyl kinase/gamma-glutamyl phosphate reductase, for improved osmotic tolerance of Escherichia coli transformants. Fems Microbiol. Lett. 263:41-47.
- Itikawa H, Baumberg S, Vogel HJ. 1968. Enzymatic basis for a genetic suppression: accumulation and deacylation of N-acetylglutamic γ-semialdehyde in enterobacterial mutants. Biochim. Biophys.
- Chen MQ, Wie HB, Cao JW, Liu RJ, Wang YL, Zheng CY. 2007. Expression of Bacillus subtilis proBA genes and reduction of feedback inhibition of proline synthesis increases proline production and confers osmotolerance in transgenic Arabidopsis. J. Biochem. Mol. Biol. 40:396-403.
- Gardan R, Rapoport G, Debarbouille M. 1995. Expression of the rocDEF operon involved in arginine catabolism in Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 249:843-856.
- Belitsky BR, Sonenshein AL. 2013. Genome-wide identification of Bacillus subtilis CodY-binding sites at single-nucleotide resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:7026-7031.
- Steil L, Hoffmann T, Budde I, Völker U, Bremer E. 2003. Genome-wide transcriptional profiling analysis of adaption of Bacillus subtilis to high salinity. J. Bacteriol. 185:6358-6370.
- Hecker M, Schumann W, Völker U. 1996. Heat-shock and general stress response in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 19:417-428.
- Srivatsan A, Han Y, Peng J, Tehranchi AK, Gibbs R, Wang JD, Chen R. 2008. High-Precision, Whole-Genome Sequencing of Laboratory Strains Facilitates Genetic Studies. Plos Genetics 4:E1000139.
- Ruzal SM, Sanchez-Rivas C. 1998. In Bacillus subtilis DegU-P is a positive regulator of the osmotic response. Curr. Microbiol. 37:368-72.
- Booth IR, Louis P. 1999. Managing hypoosmotic stress: aquaporins and mechanosensitive channels in Escherichia coli. Curr. Opin. Microbiol. 2:166-169.
- Sukharev SI, Blount P, Martinac B, Kung C. 1997. Mechanosensitive channels of Escherichia coli: the mscL gene, protein and activities. Annu. Rev. Physiol. 59:633-657.
- Galinski EA, Trüper HG. 1994. Microbial behaviour in salt-stressed ecosystems. FEMS Microbiol.
- Brown AD. 1976. Microbial water stress. Bacteriol. Rev. 40:803-846.
- Harwood CR, Cutting SM. 1990. Molecular biological methods for Bacillus, John Wiley & Sons, Inc., Chichester, UK.
- Calamita G, Bishani WR, Preston GM, Guggine WB, Agre P. 1995. Molecular cloning and charcterization of AqpZ, a water channel from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 270:29063-66.
- Perez-Arellano I, Carmona-Alvarez F, Gallego J, Cerverra J. 2010 b. Molecular mechanism modulating glutamate kinase activity. Identification of the proline inhibitor binding site. J. Mol. Biol.
- Belitsky BR, Brill J, Bremer E, Sonenshein AL. 2001. Multiple genes for the last step of proline biosynthesis in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 183:4389-4392.
- Blount P, Schroeder MJ, Kung C. 1997. Mutations in a bacterial mechanosensitive channel change the cellular response to osmotic stress. J. Biol. Chem. 272:32150-32157.
- Hecker M, Völker U. 1998. Non-specific, general and multiple stress resistance of growth-restricted Bacillus subtilis cells by the expression of the sB regulon. Mol. Microbiol. 29:1129-1136.
- Costilow RN, Laycock L. 1971. Ornithine cyclase (deaminating): purification of a protein that converts ornithine to proline and definition of the optimal assay conditions. J. Biol. Chem. 246:6655- 6660.
- Boch J, Kempf B, Bremer E. 1994. Osmoregulation in Bacillus subtilis: synthesis of the osmoprotectant glycine betaine from exogenously provided choline. J. Bacteriol. 176:5364-5371.
- Brill J, Hoffmann T, Bleisteiner M, Bremer E. 2011 b. Osmotically controlled synthesis of the compatible solute proline is critical for cellular defense of Bacillus subtilis against high osmolarity.
- Kuwayama H, Obara S, Morio T, Katoh M, Urushihara H, Tanaka Y. 2002. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30:E2.
- Bovell CR, Packer L, Helgerson R. 1963. Permeability of Escherichia coli to organic compounds and inorganic salts measured by light scattering. Biochim. Biophys. Acta. 75:257-266.
- Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell. Mol. Life Sci. 67:2511-2532.
- Curtis TP, Sloan WT. 2004. Prokaryotic diversity and its limits: microbial community structure in nature and implications for microbial ecology. Curr. Opin. Microbiol. 7:221-226.
- Berg CM, Rossi JJ. 1974. Proline excretion and indirect suppression in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 118:928-934.
- Craig LC, Gregory JD, & Barry GT. 1949. Purity studies on polypeptide antibiotics: bacitracin. J. Clin.
- Costilow RN, Laycock L. 1969. Reactions involved in the conversion of ornithine to proline in Clostridia. J. Bacteriol. 100:662-667.
- Burg M, Kwon E, Kültz D. 1997. Regulation of gene expression by hypertonicity. Annu. Rev. Physiol.
- Calamita G, Kempf B, Bonhivers M, Bishai WR, Bremer E, Agre P. 1998. Regulation of the Escherichia coli water channel gene aqpZ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3627-3631.
- Zhang CS, Lu Q, Verma DP. 1995. Removal of feedback inhibition of ∆1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, a bifunctional enzyme catalyzing the first two steps of proline biosynthesis in plants. J.
- Calogero S, Gardan R, Glaser P, Schweizer J, Rapoport G, Debarbouille M. 1994. RocR, a novel regulatory protein controlling arginine utilization in Bacillus subtilis, belongs to the NtrC/NifA family of transcriptional activators. J. Bacteriol. 176:1234-1241.
- Gardan R, Rapoport G, Debarbouille M. 1997. Role of the transcriptional activator RocR in the arginine-degradation pathway of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 24:825-837.
- Buxton RS. 1980. Selection of Bacillus subtilis 168 mutants with deletions of the PBSX prophage. J.
- Bernhardt J, Völker U, Völker A, Antelmann H, Schmid R, Mach H, Hecker M. 1997. Specific and general stress proteins in Bacillus subtilis - a two-deimensional protein electrophoresis study.
- Brill J, Hoffmann T, Putzer H, Bremer E. 2011 a. T-box-mediated control of the anabolic proline biosynthetic genes of Bacillus subtilis. Microbiology 157:977-987.
- Carpita NC. 1985. Tensile strength of cell walls of living cells. Plant Pysiol. 79:485-88.
- Calamita G. 2000. The Escherichia coli aquaporin-Z water channel. Mol. Microbiol. 37:254-262.
- Hayzer DJ, Leisinger T. 1980. The gene-enzyme relationships of proline biosynthesis in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 118:287-293.
- Bolen DW, Baskakov IV. 2001. The osmophobic effect: natural selection of a thermodynamic force in protein folding. J. Mol. Biol. 310:955-963.