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Titel:Biochemical investigations on bacterial and fungal prenyltransferases
Autor:Fan, Aili
Weitere Beteiligte: Li, Shu-Ming (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2015
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2015/0371
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2015-03712
DOI: https://doi.org/10.17192/z2015.0371
DDC:610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Biochemische Untersuchungen an bakteriellen und pilzlichen Prenyltransferasen
Publikationsdatum:2016-02-04
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Dipeptide, Tryptophan, Dimethylallyl-Transferase <Dimethylallyl-trans-Transferase>, Biokatalysator, Dipeptide, Tyrosine, Biocatalyst, Tyrosin, Dimethylallyltransferase, Tryptophan

Summary:
Prenylierte Substanzen sind in der Natur weitverbreitet und weiseneine erstaunliche strukturelle Diversitätauf. Sie besitzen häufigeine vielversprechende biologische Aktivität, was sie von ihren unprenylierten Vorstufenunterscheidet. Daher werden sie von Wissenschaftlern aus verschiedenen Disziplinen umfangreich untersucht.Die Forschung beinhaltet deren Biosynthese unddie daran beteiligten Schlüsselenzyme, wie z. B. Prenyltransferasen, die maßgeblich an der strukturellen Vielfalt und biologischen Aktivität beteiligt sind. Prenyltransferasen katalysieren die Übertragung einer Prenyleinheit von unterschiedlichen Prenyldonoren auf verschiedene aliphatische oder aromatische Akzeptoren. Diese Dissertation beschäftigt sich mit den Prenyltransferasen der Dimethylallyltryptophansynthase (DMATS) Superfamilie. Die Prenyltransferase TyrPT, ein neues Mitglied dieser Superfamilie, wurde biochemisch in vitro charakterisiert. Das verantwortliche GenAn13g01840 wurde zuvor in der Genomsequenz von A. niger identifiziert und in pET28a kloniert. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, dass TyrPT sowohl die O-Prenylierung von Tyrosin als auch die C7-Prenylierung von Tryptophan katalysiert. Weiterhin wurde dieses Enzym mit der bekannten Tyrosin-O-Prenyltransferase SirD und der Tryptophan-C7 Prenyltransferase 7-DMATS gegenüber einer Reihe von Tyrosin- und Tryptophan-Derivate als Substrate verglichen. TyrPT wies ein breiteres Substratspektrum sowieeine deutlich höhere katalytische Aktivität für verschiedeneSubstrate auf, als die zwei anderen Enzyme. Ebenso wurden die kinetischen Parameter der TyrPT-Reaktionen mitzehn Substraten bestimmt. Diese Arbeitliefert nicht nur ein neues Enzym, sondern vergröβert auch unser Wissen über dieBeziehungenderTyrosin-O- und Tryptophan-C-Prenyltransferasen. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Tryptophan-Prenyltransferasen FgaPT2 und 7-DMATS auch Tyrosin und dessen Derivate als Substrate akzeptieren und jeweils eine C3- und O-Prenylierung katalysieren. Ein Mechanismus der FgaPT2-Reaktion mit Tyrosin wurde durchmolekulares modellieren („molecularmodeling“) basierend auf der verfügbaren Kristallstruktur postuliert. Ausgehendvon dieser Hypothese wurden 16 FgaPT2-Mutanten mit Tryptophan und Tyrosine als Substrate getestet. Die Mutante K174F zeigte eine viel höhere katalytische Aktivität gegenüber Tyrosin als FgaPT2, jedoch kaum Aktivität mit Tryptophan. Somit wurde die Tryptophan-C4-Prenyltransferase durch zielgerichtete Mutagenese zu einer spezifische Tyrosin-C3-Prenyltransferase umgewandelt. Diese Strategie wurde auch eingesetzt um diekatalytische Aktivität von FgaPT2 als C4-prenylierendes Enzym von zyklischen Dipeptidenzu erhöhen. 13 FgaPT2-Mutanten mit deutlichhöherer katalytischer Aktivität und unterschiedlichen Substratspräferenzengegenüber Dipeptidenkonntenals neue Biokatalysatoren erhalten werden. Motiviert durch die zuvorgenannten Ergebnisse wurden zwei Analoga von L-Tyrosin, L o- und L-m-Tyrosin, mit den Tryptophan-Prenyltransferasen FgaPT2, 5-DMATS, 6-DMATSSv und 7-DMATS sowie den Tyrosin-Prenyltransferases SirD und TyrPT getestet. Interessanterweise akzeptierte SirDdie zwei Tyrosin Analoga nur gering. Im Gegensatz dazu, wiesen die Tryptophan-Prenyltransferasen eine höhere katalytische Aktivität gegenüber diesen Substraten auf. Durch Produkt-Isolierung und Strukturaufklärung konnte bezüglich TyrPT und den Tryptophan-PrenyltransferasenC5-prenyliertes o-Tyrosin als einzigesProdukt nachgewiesen werden. Für die FgaPT2-Reaktion wurden C4- und C6-prenyliertes m-Tyrosin identifiziert. Diese Ergebnisse lassen erkennen, dass die Grund Strukturder Substrate keine essentielle Rolle für die Akzeptanz von Tryptophan- oder Tyrosin-Prenyltransferasen spielt, sondern von der Substitutionsposition der funktionellen Gruppe am aromatischen Kern abhängt, welche in direkte Wechselwirkung mit dem aktiven Zentrum des Enzyms tritt. Die zuvor beschriebenen Ergebnisse verdeutlichen die breite Substratspezifität der DMATS-Enzyme. Die Tryptophan-Prenyltransferasen akzeptieren jedoch die zyklischenDipeptide nur bei hohen Proteinkonzentrationen. Im Gegenzug stellt Tryptophan ein sehr schlechtes Substrat für zyklische Dipeptid-Prenyltransferasen dar. Die Substratpromiskuität der Indol-Prenyltransferasen, einschließlich der Tryptophan- und tryptophanhaltigenzyklischenDipeptid-Prenyltransferasen wurde durch das unnatürliche Substrat cyclo-L-homotryptophan-D-valin, welches ein zusätzliches C-Atom zwischen denIndol- und Diketopiperazinringen besitzt, erweitert. Alle drei getestetenTryptophan-Prenyltransferasen sowie die fünf zyklischenDipeptid-Prenyltransferasen akzeptierten das Substrat sehr gut. Sieben prenylierte Produkte mitjeweils einer Prenylgruppe an jeder Position des Indolkerns wurden aus den Enzymreaktionen isoliert. Damit wurden erstmals sieben monoprenylierte Produkte aus einem Substrat in einstufigen Reaktionenproduziert. Die aus dieser Dissertation hervorgegangenen Ergebnisse demonstrieren, dass die Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie eine wertvolle Quelle für Biokatalysatoren darstellen unddamit eine wichtige Rolle in der Produktionprenylierter Verbindungen spielen könnten.

Zusammenfassung:
Prenylated natural products are widely distributed in nature and demonstratean amazing varietyof structures and promising biological activities, which are usually distinct from their non-prenylated precursors. Therefore, they are intensively studied by researchers from different disciplines. These includeinvestigationson their biosynthesis as well as on the involved key enzymes such as prenyltransferases, which contribute significantly to the structural diversity and biological activity. Prenyltransferases catalyze the transfer reactionsof prenyl moietiesfrom different prenyl donors to various aliphatic or aromatic acceptors.This thesis focuses on the prenyltransferases from the dimethylallyltryptophan synthase (DMATS) superfamily. A new member of this superfamily TyrPT was characterized biochemically in vitro. The responsible geneAn13g01840had been identified in the genome sequence ofA.niger and cloned into pET28a. In this thesis, TyrPT was found to catalyze theO-prenylation of tyrosine as well as C7-prenylation of tryptophan. It was further compared with the known tyrosine O-prenyltransferase SirD and tryptophan C7-prenyltransferase 7 DMATS toward a series of tyrosine and tryptophan derivatives. TyrPT exhibited a broader substrate spectrum and significantly higher catalytic activity for several substrates than the other two enzymes.Kinetic parameters of TyrPT reactions withten substrateswere determined.This studynot only providesanew enzyme,but also enhances the relationshipsbetween tyrosine O- andtryptophan C-prenyltransferases. Further studiesdemonstrated that tryptophan prenyltransferases FgaPT2 and 7-DMATS also accepted tyrosine and its derivatives as substrates and catalyzed a unique C3- and O-prenylation, respectively. A mechanism ofthe FgaPT2 reaction with tyrosine was proposed based on the molecular modeling results with the available crystal structure of FgaPT2.Based on this hypothesis, sixteen mutated FgaPT2 derivatives were tested with tryptophan and tyrosine as substrates. The mutant K174F demonstrated much higher catalytic ability toward tyrosine than FgaPT2 and showed almost no activity toward tryptophan. Therefore, tryptophan C4-prenyltransferase was switched to a specific tyrosine C3-prenyltransferase by site-directed mutagenesis. This strategy was also used for enhancing thecatalytic activity of FgaPT2as a C4-prenylating enzyme of cyclic dipeptides. Thirteen mutated FgaPT2 with much higher catalytic activities and different substrate preferences toward cyclic dipeptides were obtained as new biocatalysts. Inspired by the results above, the L-tyrosineanalogs,L-o- andL-m-tyrosine, were tested with the tryptophan prenyltransferases FgaPT2, 5-DMATS, 6-DMATSSv and 7 DMATS as well as the tyrosine prenyltransferases SirD and TyrPT. Surprisingly,SirD hardly accepted thesetyrosine analogs. In contrast,tryptophan prenyltransferases generally demonstrated higher catalytic activities toward these two substrates. Product isolation and structure elucidation proved C5-prenylated o-tyrosine as unique product of these enzymes, and both C4- andC6-prenylated derivativeswere identified as the products of the FgaPT2 reaction with L-m-tyrosine.These results revealed that chemical category of the aromatic nucleus was not the essential featureforthe acceptance of a substrate by tryptophan or tyrosine prenyltransferases. It strongly depends on thesubstitution positions of the functional groups on the aromatic nucleus, which directly interact with the enzyme active sites. Aforementioned results exhibitfairly the broad substrate spectra of DMATS enzymes. However, the tryptophan prenyltransferases usually accepted cyclic dipeptides only at high protein concentrations.Consequently, tryptophan was a verypoor substrate for cyclic dipeptide prenyltransferases. In this thesis, the substrate promiscuity of indole prenyltransferases including tryptophan and tryptophan-containing cyclic dipeptide prenyltransferases was further expanded by their acceptance of the synthesized unnatural cyclo-L-homotryptophan-D-valine with one additional C-atom between the indole and the diketopiperazine rings.This compound was well accepted by all the tested prenyltransferases including three tryptophan and five cyclic dipeptide prenyltransferases. Seven prenylated products with one prenyl moiety at each position of the indole nucleus were isolated from the enzyme assays.This was the firstreport on the production of seven monoprenylated productsfrom one substrate by one-step reactions. The results presented in this thesis demonstrate that prenyltransferases of theDMATS superfamily are a rich source of biocatalysts, which could play an important role forproduction of prenylated compounds.


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