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Zusammenfassung:
Die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) ist eine Serin/Threonin-Kinase mit bedeutender Funktion bei der Desensibilisierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren. Die agonistabhängige Rekrutierung der GRK2 zu aktivierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren durch Interaktion mit freien Gβγ-Untereinheiten und negativ geladenen Phospholipiden der Membran wurde bereits detailliert erforscht (Pitcher et al., 1992; Touhara et al., 1995). Auch Gαq war als Interaktionspartner der GRK2 bekannt (Carman et al., 1999b). Die GRK2 kann damit auch als Effektor der G-Proteine angesehen werden, der eine phosphorylierungs-unabhängige Desensibilisierung der Rezeptoren durch Sequestrierung aktiver Gq-Protein-Untereinheiten bewirkt. Bisher war allerdings wenig darüber bekannt, ob und welche weiteren Funktionen die Interaktion von Gαq und GRK2 in Bezug auf die Signalweiterleitung Gq Protein-gekoppelter Rezeptoren besitzt. Darüber hinaus fehlte die detaillierte kinetische Beschreibung der agonistabhängigen Rekrutierung der GRK2 zu aktivierten Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren, sowie der Dissoziation des Komplexes nach Auswaschen des Agonisten. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Dynamik der Interaktion der GRK2 mit Gq Protein-gekoppelten Rezeptoren und anderer an der Rekrutierung der GRK2 beteiligter Interaktionen am Beispiel des M3-Acetylcholin (ACh) Rezeptors aufzuklären. Außerdem wurde in diesem Zusammenhang der Einfluss der Gαq-Bindung an die GRK2 untersucht. Dazu wurden neue Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET)-basierte Experimente etabliert, mit deren Hilfe die Interaktion der GRK2 mit M3-ACh-Rezeptoren sowie mit Gαq und Gβγ mit hoher zeitlicher Auflösung in einzelnen lebenden HEK293T-Zellen sichtbar gemacht werden konnte. Die Stimulation der M3-ACh-Rezeptoren mit Acetylcholin führte zu deutlichen FRET-Änderungen, welche die Interaktion der jeweiligen Partner widerspiegelten. Zur Untersuchung des Einflusses der Bindung der Gq-Protein-Untereinheiten an die GRK2 wurden GRK2-Mutanten eingesetzt, die eine reduzierte Bindeaffinität zu Gαq oder Gβγ aufweisen. Die Funktion von Gβγ bei der Membrantranslokation der GRK2, die bisher nur über Endpunktmessungen beschrieben wurde, konnte in dieser Arbeit durch den Einsatz der FRET-Mikroskopie und anderer fluoreszenzmikroskopischer Methoden bestätigt und darüber hinaus erstmals dynamisch vermessen werden. Zusätzlich ergaben die Experimente, dass nicht nur Gβγ, sondern auch Gαq in der Lage ist, die GRK2 agonistabhängig an die Membran zu rekrutieren. Dies stellt einen neuen Aspekt in der Membrantranslokation der GRK2 dar. Ein Vergleich der absoluten FRET-Amplituden der unterschiedlichen GRK2-Mutanten zeigte, dass Gαq zudem das Ausmaß und die Stabilität der Interaktion zwischen GRK2 und dem M3 ACh-Rezeptor erhöht. Funktionelle Untersuchungen zur Kinaseaktivität der GRK2 konnten außerdem nachweisen, dass die Bindung von Gβγ an GRK2 zwar notwendige Bedingung für die Phosphorylierung des Rezeptors ist, eine effiziente Rezeptor-phosphorylierung aber nur bei gleichzeitiger Bindung von Gβγ und Gαq an die GRK2 möglich ist. Diese Ergebnisse belegten die wichtige Funktion von Gαq bei der Rekrutierung der GRK2 zum M3 ACh-Rezeptor, auch wenn Gβγ bei der Rekrutierung der GRK2 die größere Rolle spielt. Allerdings bewies die höhere Sensitivität der GRK2-Gαq-Interaktion gegenüber der Interaktion zwischen GRK2 und Gβγ, dass die GRK2 eine höhere Bindeaffinität zu Gαq als zu Gβγ besitzt. Die Bedeutung von Gαq bei der Rekrutierung der GRK2 zum Rezeptor wird deshalb bei niedrigen Agonist-Konzentrationen vermutlich verhältnismäßig wichtiger sein. Ein Effekt aktivierter Gαq-Untereinheiten auf die Rekrutierung von GRK2 zu Gi-Protein-gekoppelten Rezeptoren konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht beobachtet werden, so dass der Einfluss von Gαq sehr wahrscheinlich auf Gq Protein-gekoppelte Rezeptoren beschränkt ist. Die durchgeführten FRET-Experimente ermöglichten erstmals die detaillierte kinetische Beschreibung der Rekrutierung der GRK2 zum Rezeptor, beginnend bei der Interaktion inaktiver G-Proteine mit aktiven M3-ACh-Rezeptoren bis hin zur Bildung eines Komplexes aus GRK2, Gαq, Gβγ und Rezeptor. Es zeigte sich, dass die Interaktion der GRK2 mit Gβγ etwa 3-mal schneller war als die Gαq Bindung. Die Membrantranslokation der GRK2 durch die Gq-Protein-Bindung ist dabei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Interaktion der GRK2 mit dem Rezeptor. Die, in Anwesenheit von Gαq, lang anhaltende Interaktion der GRK2 mit dem M3-ACh-Rezeptor lieferte einen Hinweis darauf, dass die Signalweiterleitung des Rezeptors bereits durch die Bindung der GRK2 gehemmt wird, und nicht erst durch die Rekrutierung von Arrestin, wie bisher vermutet. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal die wichtige Rolle von Gαq bei der Rekrutierung der GRK2 zum M3 ACh-Rezeptor beschrieben werden, die entscheidenden Einfluss auf die Signalweiterleitung und Desensibilisierung Gq-Protein-gekoppelter Rezeptoren ausübt. Darüber hinaus konnte die kinetische Beschreibung der beteiligten Vorgänge erstmals den zeitlichen Ablauf dieses physiologisch wichtigen Signalwegs entschlüsseln.

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12. Tabelle 20: Auswertung der " Offset " -Kinetik der Interaktion zwischen Gα q -YFP und Cer-Gβ 1
13. Tabelle 19: Auswertung der " Onset " -Kinetik der Interaktion zwischen Gα q -YFP und Cer-Gβ 1
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29. Abbildung 42: " Offset " -Kinetik des FRET-Signals zwischen Cer-Gβ 1 und M 3 -AChR-YFP in An-oder Abwesenheit von GRK2 oder den unterschiedlichen GRK2-
30. Abbildung 41: " Onset " -Kinetik des FRET-Signals zwischen Cer-Gβ 1 und M 3 -AChR-YFP in An-oder Abwesenheit von GRK2 oder den unterschiedlichen GRK2-
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