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Titel: Genetische und biochemische Charakterisierung der Itaconsäure-Biosynthese in Ustilago maydis
Autor: Przybilla, Sandra Kathrin
Weitere Beteiligte: Bölker, Michael (Prof. Dr,)
Erscheinungsjahr: 2015
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2014/0414
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2014-04141
DOI: https://doi.org/10.17192/z2014.0414
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Genetic and biochemical characterization of the itaconic acid biosynthesis in Ustilago maydis

Dokument

Schlagwörter:
Itaconsäure, Gencluster, Biotechnologie, Ustilago zeae, bio-based chemical building block, Sekundärmetablismus, metabolic engineering, secondary metabolism, gene cluster

Zusammenfassung:
Die ungesättigte Dicarbonsäure Itaconsäure wird durch mikrobielle Fermentation erzeugt und dient als Ausgangsstoff für die Produktion von Kosmetika, Klebstoffen oder sogar Biokraftstoff. Der phytopathogene Basidiomycet Ustilago maydis produziert unter bestimmten Bedingungen eine Vielzahl an Sekundärmetaboliten, zu denen auch die Itaconsäure gehört. Der Biosyntheseweg der Itaconsäure war jedoch in diesem Pilz bisher noch nicht bekannt. In dieser Arbeit wurden die für die Itaconsäure-Biosynthese in U. maydis verantwortlichen Gene identifiziert und charakterisiert. Alle beteiligten Gene sind in einem Gencluster organisiert, der durch den Transkriptionsfaktor Ria1 spezifisch reguliert wird. Anhand von Deletionsanalysen der entsprechenden Gene konnte gezeigt werden, dass in U. maydis zwei Enzyme essentiell für die Synthese von Itaconat sind. Im Verlauf dieser Arbeit wurde die enzymatische Aktivität dieser Enzyme bestimmt. Dabei wurde gezeigt, dass das PrpF-ähnliche Protein Aconitat-Δ-Isomerase (Adi1) die Umwandlung von cis- zu trans-Aconitat und damit den ersten Schritt der Itaconsäure-Biosynthese in U. maydis katalysiert. Der zweite Schritt wird durch das zweite essentielle Enzym trans-Aconitat-Decarboxylase (Tad1) katalysiert, das die Decarboxylierung von trans-Aconitat zu Itaconat vermittelt. Basierend auf diesen Daten konnte ein Modell für den Itaconsäure-Biosyntheseweg in U. maydis aufgestellt werden. Es wird angenommen, dass cis-Aconitat durch den mitochondriellen Transporter Ctp1 vom Mitochondrium ins Cytosol exportiert wird. Dort dient es als Substrat für Adi1, das die Isomerisierung zu trans-Aconitat katalysiert. Trans-Aconitat wird anschließend durch Tad1 zu Itaconat decarboxyliert, das vermutlich durch den Plasmamembran-Transporter Itp1 aus der Zelle transportiert wird. Der Itaconsäure-Gencluster ist während der pathogenen Entwicklung von U. maydis stark exprimiert. In dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass die Produktion von Itaconsäure während der biotrophen Phase nicht essentiell ist. Damit bleibt die biologische Rolle der Itaconsäure-Produktion für U. maydis weiterhin unklar. Im Verlauf dieser Arbeit wurde noch ein zweiter Gencluster in U. maydis identifiziert, der Ähnlichkeiten zum Itaconat-Gencluster aufweist. Dieser Gencluster enthält ein Gen für eine Aconitat Δ-Isomerase (adi2 ), die in der Lage ist, die Funktion von Adi1 vollständig zu ersetzen. Durch Wachstumstests konnte gezeigt werden, dass der Adi2-Gencluster für die Verstoffwechselung von cis- und trans-Aconitat essentiell ist, das sich auch in der Wirtspflanze Zea mays findet. Die Fähigkeit, trans-Aconitat als Kohlenstoffquelle zu verwenden, ist für U. maydis während der pathogenen Entwicklung möglicherweise von Vorteil, es konnte jedoch gezeigt werden, dass diese Fähigkeit nicht essentiell für die pathogene Entwicklung von U. maydis ist.

Summary:
The unsaturated dicarboxylic acid itaconic acid is a bio-based chemical building block used in the industrial production of plastics, paints and cosmetics. Currently, itaconic acid is produced by fermentation of Aspergillus terreus. The phytopathogenic basidiomycete Ustilago maydis produces a variety of secondary metabolites e.g. itaconic acid under certain environmental conditions. The biosynthetic route of itaconate in this fungus, however, has not been elucidated, yet. The U. maydis genome contains a gene cluster comprising all the genes required for itaconic acid biosynthesis. This gene cluster is specifically regulated by the transcriptional regulator Ria1. Deletion analysis showed that U. maydis contains two genes essential for itaconate production coding for a PrpF-like enzyme and a CMLE-like enzyme. The activity of these enzymes has been identified by in vitro studies with the purified proteins. The PrpF-like enzyme aconitate-∆-isomerase (Adi1) catalyzes the first step of the itaconic acid biosynthesis pathway by isomerisation of cis-aconitate. The resulting trans-aconitate serves as a substrate for the trans-aconitate decarboxylase (Tad1), which catalyzes decarboxylation of trans-aconitate to form itaconate. A hypothetical pathway for itaconic acid biosynthesis in U. maydis has been modeled based on these data: cis-aconitate, which is a natural intermediate of the citric acid cycle, is probably exported from the mitochondria into the cytoplasm by the mitochondrial transporter Ctp1. In the cytoplasm cis-aconitate is converted to trans-aconitate by Adi1 and trans-aconitate is subsequently decarboxylated to itaconate by Tad1. Finally itaconate secretion into the surrounding medium is probably mediated by the MFS-transport protein Itp1. The itaconic acid gene cluster is highly expressed during pathogenic development of U. maydis. It has been demonstrated, however, that biosynthesis of itaconate is not essential for pathogenic development. Therefore, the biological role of itaconate for U. maydis is still unknown. The U. maydis genome contains a second gene cluster, which shows some similarities to the itaconic acid gene cluster. The PrpF-like enzyme Adi2, which is part of this gene cluster, is able to replace Adi1 in the itaconic acid pathway in vitro and also in vivo. Furthermore, growth assays showed that the small gene cluster of Adi2 is required for the metabolization of cis- and trans-aconitate. Trans-aconitate is known to be produced by the U. maydis host plant Zea mays. Therefore the ability to metabolize trans-aconitate might be an advantage for the fungus, even though pathogenicity tests showed that the Adi2 gene cluster is not required for the pathogenic development of U. maydis.


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