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Titel: Analyse von B-lymphozytären Subpopulationen des darmassoziierten lymphatischen Gewebes
Autor: Maskow, Corinna
Weitere Beteiligte: Maier, R.F. (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2013
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2013/0166
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2013-01660
DOI: https://doi.org/10.17192/z2013.0166
DDC: Medizin
Titel(trans.): Analysis of B-lymphocyte Subsets from Gut-Associated Lymphoid Tissue
Publikationsdatum: 2013-03-27
Lizenz: https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Immunkomplex, CDR3, Immunglobulin M, CDR3, Antigen, DNS-Sequenz, Immunglobulin A

Zusammenfassung:
ZUSAMMENFASSUNG Hintergrund: Das primäre und sekundäre Immunglobulinrepertoire bilden eine bedeutende Grundlage der Pathogenbekämpfung im Wirbeltier. Das Mukosa-assoziierte lymphatische Gewebe stellt hierbei die erste Front des humoralen Immunsystems gegen invasive Infektionen dar. An der Mukosa überwiegt das Immunglobulin A, welches sowohl in das Plasma als auch auf die Schleimhaut sezerniert werden kann. Eine Differenzierung der B-Lymphozyten zu Plasma- und Gedächtniszellen gewährleistet bei erneuter Infektion mit dem gleichen Pathogen eine viel schnellere und effektivere Immunantwort. Fragestellung: Unklar sind grundlegende Fragen zur Entwicklung der B-Zell- bzw. Antikörper-Repertoires im darmassoziierten lymphatischen Gewebe (gut-associated lymphoid tissue: (GALT): Welchem Selektionsdruck unterliegt das B-Zell-Repertoire während des Klassenwechsels zu IgA? Weiterhin ist nicht bekannt, nach welchen Kriterien Lymphozyten in den Pool der IgA-bildenden Gedächtnis- und Plasmazellen rekrutiert werden. In dieser Arbeit haben wir die Hypothese geprüft, dass IgA-bildende Subpopulationen der Gedächtnis- und Plasmazellen nicht zufällig, sondern aufgrund ihrer Antigen-Bindungseigenschaften rekrutiert werden. Methoden: Wir haben mittels Durchflusszytometrie Plasma- und Gedächtniszellen aus Peyerschen Plaques adulter BALB/C Wildtyp-Mäuse separiert und mittels Reverse Transkriptase-PCR selektiv IgM- und IgA-Transkripte der schweren Immunglobulin-Ketten amplifiziert und kloniert. Die so gewonnenen Transkripte wurden sequenziert und mittels Datenbankanalyse (Alignment mittels IMGT VQuest) ausgewertet. Ergebnisse: Es wurden insgesamt 413 Immunglobulinsequenzen in vier unabhängigen Experimenten erhoben, von denen sich 323 (78%) als nicht-redundante Transkripte erwiesen. Immunglobulin A-Sequenzen der Gedächtnis- und Plasmazellen wiesen mit 74% bzw. 72% eine signifikant niedrigere klonale Diversität auf als Immunglobuline der Klasse M (94%; jeweils p<0,01). Immunglobulin A-Sequenzen der Gedächtnis- und Plasmazellen enthielten mehr somatische Mutationen (37‰ bzw. 35‰) als IgM-Sequenzen (14‰, p<0,01). Bei IgA-Sequenzen aus Gedächtniszellen waren weniger zufällige, sogenannte N-Nukleotide innerhalb der Antigen-Bindungsstelle vorhanden als bei IgA-Sequenzen aus Plasmazellen (p<0,01). Zusätzlich wiesen IgA-Sequenzen aus Gedächtniszellen im Vergleich zu IgM-Sequenzen signifikant kürzere CDR3-Regionen auf (p<0,05) bei signifikant kürzeren NDN-Regionen (p<0,01). Ein ähnlicher Trend war bei IgA-Sequenzen aus Plasmazellen erkennbar. In unserer Studie korrelierte zudem die Nutzung von JH- und VH-Gen-Familien. Diskussion: IgA-Sequenzen weisen die typischen Anzeichen der klassischen Antigenselektion auf. Die eingeschränkte klonale Diversität und die erhöhte Mutationsrate der IgA-Transkripte aus Gedächtnis- und Plasmazellen gegenüber IgM-Transkripten der gleichen Gewebeproben belegt eine Antigen-abhängige fokussierte Selektion während des Klassenwechsels von IgM zu IgA. Interessanterweise wiesen Immunglobuline A der Gedächtniszellen eine andere Binnenstruktur innerhalb der Antigen-Bindungsstelle (CDR-H3) auf als Immunglobuline M. Daher haben IgA aus Gedächtniszellen gegenüber IgM eine geringere strukturelle Vielfalt und im Durchschnitt eine flachere Antigen-Bindungsstelle, wodurch eine engere Interaktion mit dem Antigen möglich ist. Im Gegensatz zu früheren Annahmen beeinflußt die VH-Segment-Nutzung die JH-Segment-Nutzung und damit die Zusammensetzung der CDR3-Region eines Immunglobulins. Schlussfolgerung: Immunglobulin A produzierende Gedächtnis- und Plasmazellen stellen separate Populationen mit unterschiedlichen Repertoires an Antigen-Bindungsstellen innerhalb ihrer Antikörper dar. Sie weisen alle Charakteristika einer individuellen Antigen-abhängigen Selektion auf. Dies weist darauf hin, dass die CDR3-Region ein entscheidender Selektionsfaktor während des Klassenwechsels zu IgA darstellt.

Summary:
SUMMARY Background: The primary and secondary immunoglobulin repertoires represent an important basis of the pathogen defence in the vertebrate. The mucosa-associated lymphoid tissue plays a crucial role in the establishment and maintenance of mucosal homeostasis against invasive infections. Inside mucosal tissues, Immunoglobulin A (Ig A) is the predominating immunoglobulin that is secreted into the blood plasma, as well as onto the mucous membrane. The differentiation of antigen-activated B-cells into plasma and memory cells allows a quicker and more effective immune response in case of a recurrent confrontation with the same pathogen. Basic mechanisms concerning the development of B-cell and antibody repertoires are still unclear. Objective: It remains uncertain which selective pressure acts upon the B-cell repertoire during the class switch recombination from IgM to IgA in germinal centres. Furthermore it is unknown which criteria drive the recruitment of lymphocytes into the pool of IgA producing memory and plasma cells. In this work, we tested the hypothesis that subpopulations of IgA producing memory and plasma cells are not recruited by chance, but on the basis of their antigen binding properties. Methods: IgM producing B-cells as well as IgA producing memory and plasma cells were separated from Peyer’s patches of four adult BALB/C wildtype mice using flow cytometry. Using reverse transcriptase-PCR, we selectively amplified and cloned IgM and IgA transcripts of the immunoglobulin heavy chains. The transcripts were sequenced and nucleotide sequences were compared with the IMGT databases of germline sequences (Alignment via IMGT VQuest). Results: We collected a total number of 413 immunoglobulin sequences in four independent experiments of which 323 (78%) were unique. The IgA sequences of memory and plasma cells showed a significantly lower clonal diversity than IgM sequences (74% and 72% vs. 94%; p <0.01). IgA sequences of memory and plasma cells contained more somatic mutations than IgM sequences (37‰ and 35‰ vs. 14‰, p <0.01). IgA transcripts from memory cells contained a lower number of random, so-called n-nucleotides within the CDR3-regions than IgA transcripts from plasma cells (p <0.01). In comparison to the IgM sequences, the IgA sequences from memory cells showed significantly shorter CDR3 regions (p = 0.02) and significantly shorter NDN regions (p=0.0002). A similar trend was observed with IgA plasma sequences; however this was not statistically significant. Moreover, we found a preference of single JH segments depending on the rearranged VH family. Discussion: IgA showed the typical signs of classical antigen selection. In comparison to IgM transcripts from the same tissue sample, the limited clonal diversity and the increased mutation rate of IgA memory and plasma cell transcripts document an antigen dependent focused selection during the class switch from IgM to IgA. Interestingly, CDR3-regions from IgA of memory cells and IgM were differently composed. As a consequence, IgA of memory cells showed a lower structural variety and, on average, a deeper antigen binding grove compared to IgM facilitating a closer interaction with the antigen. In contrast to earlier assumptions, the use of the VH family influences the JH utilization and the composition of the CDR3 region. Conclusion: IgA producing memory and plasma cells represent separate populations with differing repertoires of antigen binding sites inside their antibodies. They both show characteristic features of an individual antigen dependent selection. Our data demonstrate that the CDR3 region is an important selection factor during class switch recombination to IgA in germinal centers.


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