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Zusammenfassung:
Basierend auf dem Grundgerüst eines 2,3,4,7-Tetrahydro-1H-azepins ist die Optimierung zu nanomolaren Plasmepsin II-Inhibitoren zur Adressierung der katalytischen Diade in Aspartyl-Proteasen gelungen. Ausgehend von (rac)-3,5-Bis-hydroxymethyl-2,3,4,7-tetrahydro-1H-azepin, welches mit seinem vermutlich protonierten endozyklischen Aminstickstoff an die beiden katalytischen Aspartate bindet, wurden durch Veresterung der beiden primären OH-Funktionen dieses Kerngerüsts entsprechende Substituenten in Position 3 und 5 des Azazyklus eingefügt und so die Spezifitätstaschen von Plasmepsin II adressiert. Mittels Docking wurden die Reste für eine optimale Ausfüllung der Subtaschen ausgewählt. Durch strukturelle Modifikation gelang die Optimierung der anfänglichen Leitstruktur. Im Zuge der Planung eines systematisch und stufenweise aufeinander aufbauenden Inhibitordesigns entschieden wir uns für einen Phenyl-Rest als bestmöglichen Startpunkt zur Adressierung der S1-Tasche von Plm II. Für die S2´-Tasche wurden Dockinglösungen, die z.B. einen p-NH2-Phenyl-Subtituenten tragen, am Besten bewertet. In einem 2. und 3. Design-Zyklus erfolgte die weitere Optimierung des P1-Restes. Als P2’-Rest wurde der zuvor optimierte p-Aminobenzoyloxymethyl-Substituent beibehalten. Im Vergleich zu der mit nur 2 Phenyl-Ringen substituierten Verbindung konnte die Affinität in 3 Design-Zyklen um den Faktor 700 für Plm II bzw. 140 für Plm IV gesteigert werden. Die gemessenen Affinitäten für humanes Cathepsin D lagen überwiegend im mittleren 3-stellig mikromolaren Bereich, womit eine gewisse Selektivität der hier synthetisierten Verbindungen für Plm II und IV erreicht wurde. Ein Vertreter dieser Verbindungen inhibierte Plm II und IV gleichermaßen gut und wies zudem Selektivität zu Cathepsin D auf. Dass die Plasmepsine eine gewisse Toleranz hinsichtlich des Abstandes der den Flap-Bereich adressierenden Akzeptor-Funktionen zeigen, konnten wir in unserer Gruppe kürzlich belegen. Deshalb sollte auch hier durch systematische Variation der C=O-Distanz der optimale Abstand dieser Akzeptor-Gruppen untersucht werden. Es wurde eine zentrale Synthesezwischenstufe entwickelt, die sowohl die Darstellung von Inhibitoren mit verkürztem als auch mit langem Akzeptor-Abstand erlaubte. Neben der Verkürzung des C=O-Abstands sollte die Synthese zudem die Einführung zusätzlicher, die S1’- bzw. S2-Tasche adressierender Substituenten ermöglichen. Der entsprechende Vertreter mit verkürztem Akzeptor-Abstand zeigte ebenfalls Affinität im mittleren mikromolaren Bereich und somit keine signifikante Verbesserung dieser. Folglich scheint die alleinige Ver-kürzung des C=O-Abstands keinen entscheidenden Einfluss auf die Affinität der Verbindung zu haben. Da auch diese Inhibitoren nur 2 Spezifitätstaschen adressieren, sollten nun durch Einführung weiterer Substituenten zusätzliche Taschen adressiert werden. Aus unserer zentralen Synthesezwischenstufe war die Darstellung entsprechender, 3 Spezifitätstaschen adressierender Inhibitoren möglich. Hier wurde wiederum der Abstand der Akzeptor-Gruppen variiert. Der 3-armige Inhibitor mit verkürztem C=O-Abstand wies einen Ki-Wert von 11,5 µM gegen Plm II auf, der entsprechende 2-armige Inhibitor einen Ki-Wert von 54 µM, so dass in diesem Fall die Affinität um ein 5-faches erhöht wurde. Die im 2. Designzyklus dargestellten 3-armigen Inhibitoren mit längerem Akzeptor-Abstand weisen alle Inhibitions-Werte im unteren mikromolaren Bereich auf und unterscheiden sich nicht signifikant voneinander. Durch die Einführung eines 3. Substituenten ist es leider nicht gelungen, eine Affinitätssteigerung zu erzielen. Nichtsdestotrotz gelang es, von einem Vertreter dieser Verbindungen eine Komplexstruktur mit der Aspartylprotease Endothiapepsin zu erhalten. Die Kristallstruktur belegt, dass das Azepin-Grundgerüst mit seinem protonierten Stickstoff die Aspartate der katalytischen Diade adressiert. Desweiteren wird in der Kristallstruktur nur das R-Enantiomer des als Racemat zur Kristallisation verwendeten Inhibitors beobachtet. Die Vorhersage unserer Modeling-Studien, dass der p-NH2-Phenyl-Rest des P2´-Substituenten H-Brücken in Richtung S2´-Tasche ausbildet und die C=O-Funktion der Amid-Bindung in Richtung Flap-Region ausgerichtet ist, wird durch die Struktur bestätigt. Entgegen der Vorhersage ist der hydrophobe p-Brom-Substituent in die S2-Tasche ausgerichtet, und der p-NH2-Phenylmethylen-Rest zeigt am Flap vorbei. Vermutlich bleibt deshalb auch der erhoffte Affinitätsgewinn der 3-armigen Inhibitoren aus. Die Ähnlichkeit zwischen Endothiapepsin und Plasmepsin ist genügend hoch, um relevante Schlüsse aus der Komplexstruktur zu ziehen. Diese Struktur legt damit den Grundstein, nun mittels strukturbasiertem Design die Azepin-basierten Inhibitoren weiter zu optimieren, nicht nur hinsichtlich ihrer Affinität gegenüber Plasmepsinen, sondern auch bezüglich ihrer Selektivität zu humanem Cathepsin D.

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