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Titel:Charakterisierung eines Ustilago maydis Genclusters, das für drei neuartige sekretierte Effektoren kodiert
Autor:Schipper, Kerstin
Weitere Beteiligte: Kahmann, Regine (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2009
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2009/0723
DOI: https://doi.org/10.17192/z2009.0723
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2009-07233
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Characterisation of a Ustilago maydis gene cluster that encodes three novel secreted proteins
Publikationsdatum:2010-01-26
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Laserscanning-Mikroskopie, Secreted effectors, Ustilago maydis, Laserscanning microscopy, Ustilago maydis, Sekretierte Effektoren

Zusammenfassung:
Der biotrophe Brandpilz U. maydis benötigt für seine Interaktion mit Maispflanzen eine Vielzahl neuartiger, vorhergesagt sekretierter Proteine, sogenannter Effektoren. Ein signifikanter Anteil der entsprechenden Gene liegt in Clustern vor, deren Expression erst während der biotrophen Phase erfolgt (Kämper et al., 2006). Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Cluster 5B charakterisiert, dessen Deletion zum Verlust der Pathogenität führt (Kämper et al., 2006). Cluster 5B codiert für drei Proteine, die ein N-terminales Signalpeptid besitzen. Es konnte gezeigt werden, dass ausschließlich eines der Gene im Cluster 5B, stp1, für den Phänotyp verantwortlich ist. stp1 findet sich auch in anderen verwandten Brandpilzen und stellt damit möglicherweise einen essentiellen Pathogenitätsfaktor von Brandpilzen dar. Mikroskopische Untersuchungen ergaben, dass stp1 Deletionsmutanten im Gegensatz zu Infektionen mit Wildtypstämmen direkt nach Penetration der Maisepidermis arretieren und in infizierten Pflanzenzellen eine verstärkte Abwehrreaktion auslösen. Diese Abwehrreaktion war durch Papillenbildung, H2O2 Akkumulation und verstärkte Synthese von PR-Proteinen gekennzeichnet und führte letztlich zum Absterben der infizierten Zellen. Dies zeigt, dass Stp1 diese Pfanzenabwehrreaktionen erfolgreich unterdrückt. Mit Hilfe von Promotor:gfp Fusionen wurde nachgewiesen, dass die Expression von Stp1 während der Pentration beginnt und vor allem auf in der Epidermis proliferierende Hyphen beschränkt ist. In Stp1 konnten bioinformatisch keinerlei bekannte Proteindomänen gefunden werden, die auf die Funktion des Proteins hindeuten könnten. Durch Deletionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die zentrale, Glycin-reiche Region des Proteins keine Funktion während der pathogenen Entwicklung hat, die N- und C-terminalen Bereiche hingegen essentiell sind. Durch die Analyse von Kulturüberständen konnte nachgewiesen werden, dass Stp1 von U. maydis Hyphen in glykosylierter Form sekretiert wird. Nach Expression in haploiden Zellen wurde hingegen eine Prozessierung des Proteins durch die Kex2 Protease beobachtet. Die Ergebnisse deuten an, dass die Sekretion des Effektors einer genauen Kontrolle unterliegt, die sowohl transkriptionell als auch post-translational erfolgt. Durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass Stp1- Fusionsproteine während der biotrophen Wachstumsphase von U. maydis in den Apoplasten gelangen. In einer Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse wurden ausschließlich intrazelluläre pflanzliche Interaktionspartner identifiziert. Stp1-Fusionsproteine, denen das N-terminale Signalpeptid fehlte, lokalisierten nach transienter Expression in Nicotiana benthamiana spezifisch in Subkompartimenten des Nukleus. Für einen der identifizierten Interaktionspartner konnte nach Co-Expression in N. benthamiana eine Colokalisierung mit Stp1 ohne Signalpeptid im Zellkern nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse könnten andeuten, dass Stp1 nach Sekretion in Pflanzenzellen transloziert wird und dort in die Regulation von Abwehrreaktionen eingreift.

Summary:
For the biotrophic interaction with its host plant maize the corn smut fungus U. maydis depends on a variety of novel secreted effector proteins. A significant number of the corresponding genes are arranged in clusters and their expression is induced specifically during biotrophic growth (Kämper et al., 2006). This study focuses on the characterization of the gene cluster 5B. Deletion of this cluster results in a complete loss of virulence symptoms in maize infections (Kämper et al., 2006). Cluster 5B encodes three novel proteins that are predicted to be secreted via canonical N-terminal signal peptides. Deletion analyses revealed that only one of the genes, stp1, is responsible for the phenotype. Since stp1 is also present in other closely related smut fungi this effector may represent a general pathogenicity factor. Microscopic analyses revealed that stp1 deletion mutants arrest directly after penetration in the maize epidermis. Furthermore, a strong plant defense response is elicited by stp1 deletion mutants, that is characterized by the formation of papillae, H2O2, induction of pr genes and finally by death of infected plant cells. This suggests that Stp1 is able to suppress plant defense reactions. Using promoter:gfp fusions stp1 expression was found to be induced during penetration and persists during growth in the maize epidermis. Since there were no bioinformatic hints towards a function of Stp1, domain analyses were performed. It could be shown that the central glycine-rich region of Stp1 is not needed for protein function while the N- and C-terminal parts are essential during biotrophic growth. Investigation of culture supernatants revealed that Stp1 is secreted in a glycosylated form by fungal hyphae. However, during expression in haploid sporidia the protein is processed by the Kex2 protease. These results demonstrate that Stp1 secretion is controlled at multiple levels including transcriptional as well as post-transcriptional mechanisms. Using confocal microscopy Stp1 fusion proteins could be localised to the apoplastic interaction zone of infected plant cells. Five intracellular plant proteins were identified to interact with Stp1 in a yeast-two hybrid screen. After transient expression in Nicotiana benthamina Stp1 lacking the signal peptide specifically localized to sub-compartments of the nucleus. Moreover, one of the interactors co-localized with Stp1 lacking the signal peptide after expression in N. benthamiana. These results might indicate that Stp1 is transferred to the plant cell where it is involved in regulation of defense responses.


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