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Titel:Charakterisierung und Struktur einer Hydroxy(phenyl)pyruvat Reduktase aus Coleus blumei
Autor:Janiak, Verena
Weitere Beteiligte: Petersen, Maike (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2007
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2008/0121
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2008-01216
DOI: https://doi.org/10.17192/z2008.0121
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Characterisation and structure of a hydroxy(phenyl)pyruvate reductase of Coleus blumei
Publikationsdatum (Online):2008-04-11

Dokument

Schlagwörter:
Photorespiration, Lichtatmung, Rosmarinsäure, Rosmarinic acid, 4-hydroxyphenylpyruvate, D-isomer-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase, Coleus blumei, 4-Hydroxyphenylpyruvat, D-Isomer-spezifische 2-Hydroxysäure Dehydrogenase, Coleus blumei

Zusammenfassung:
Das heterolog exprimierte Protein einer in der vorangegangenen Doktorarbeit von Dr. K. H. Kim als Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPPR) isolierten cDNA-Sequenz aus Suspensionkulturen von Coleus blumei wurde in dieser Arbeit charakterisiert und zwei Kristallstrukturen erstellt. Das Enzym HPPR katalysiert die Reduktion von Hydroxyphenylpyruvaten zu den entsprechenden Laktaten und soll an der Biosynthese von Rosmarinsäure in Pflanzen beteiligt sein. Nach Klonieren der putativen H(P)PR cDNA, konnte das Enzym in Bakterien exprimiert und über den durch die Expression angehängten His-Tag aufgereinigt werden. Eine Charakterisierung des Enzyms zeigte abweichende Werte zur nativen HPPR, mit einem höheren Temperaturoptimum, abweichenden Werten bei den Km-Werten für die Cosubstrate NADH und NADPH und vor allem Unterschieden in der Substratspezifität. Während für das native Enzym 4-Hydroxyphenylpyruvat (pHPP) als das natürliche Substrat mit einem apparenten Km-Wert von 10 bzw. 80 µM bestimmt wurde, lag für das gleiche Substrat bei der heterolog exprimierten H(P)PR der apparente Km-Wert mit 16,6 mM deutlich höher. Dabei sei vermerkt, dass bei der Bestimmung einiger Substrate Probleme bei der Messbarkeit auftraten und daher der Sättigungsbereich mit pHPP als Substrat nicht erreicht wurde. Weiterhin konnten Substrate identifiziert werden, die wesentlich besser umgesetzt wurden. So wurde der apparente Km-Wert von Hydroxypyruvat mit ca. 1 mM bei starker Substrathemmung und der von Glyoxylat mit 2 mM bestimmt. Eine Mutation der H(P)PR-cDNA konnte durch Klonierung und Sequenzierung der H(P)PR aus zwei Coleus blumei Pflanzen ausgeschlossen werden. Das Vorkommen sehr ähnlicher Enzyme in anderen Pflanzen, die keine Rosmarinsäure bilden, verstärkte die Vermutung, dass dem klonierten Enzym möglicherweise eine andere Hauptfunktion in vivo zukam. Bei der Suche nach verwandten Enzymen in anderen Pflanzen konnten zwei neue Sequenzen aus Paprika und Aubergine aus der Familie der Solanaceae mit einer Identität zu dem klonierten Enzym auf Aminosäure-Ebene von 83,1% bzw. 83,4% isoliert werden. Neben der Enzymcharakterisierung wurde die klonierte H(P)PR kristallisiert und sowohl eine native Struktur als auch eine NADP+-Komplextruktur bestimmt. Die Struktur weist den allgemeinen Aufbau der D-Isomer-spezifischen 2-Hydroxysäure Dehydrogenase Enzym-familie auf. Das Protein bildet zwei Domänen: Die kleinere der beiden Domänen ist für die Substratbindung verantwortlich, während die andere das Cosubstrat bindet. Zwischen den beiden Domänen liegt das katalytische Zentrum. Von verwandten Enzymen ist bekannt, dass die Domänen unterschiedliche Bindungswinkel annehmen, je nach Bindung von Substrat und Cosubstrat. Für die beiden H(P)PR-Strukturen konnte kein signifikanter Unterschied im Bindungswinkel festgestellt werden. Ein Vergleich der H(P)PR-Struktur mit anderen Kristallstrukturen zeigte trotz sehr geringer Identitäten auf Nukleotid- und Aminosäureebene eine hohe Ähnlichkeit zu einer bakteriellen D-Glycerat Dehydrogenase und einer menschlichen Glycerat Dehydrogenase/Hydroxypyruvat Reduktase. Dies könnte ein Hinweis auf die eigentliche Funktion des heterolog exprimierten Enzyms sein. Da es nicht gelungen war, pHPP im Enzym mitzukristallisieren, wurden computersimulierte Docking-Versuche durchgeführt. Dabei schien für Substrate mit Phenylring keine eindeutige Bindung vorhersagbar zu sein, während für kleinere Substrate eine eindeutigere Lösung angezeigt wurde. Diese gefundene Lösung entspräche einem Bindungsmodus, der bereits für andere Proteine vorhergesagt wurde. Die Ergebnisse aus den enzymatischen Untersuchungen und auch die Auswertung der Kristallstrukturen deuten auf eine andere Hauptfunktion des klonierten Enzymes hin, obwohl die Beteiligung an der Rosmarinsäure-Biosynthese als weitere Reaktion nicht ausgeschlossen ist. Eine mögliche Funktion könnte eine Beteiligung an der Photorespiration sein, was das Vorkommen verwandter Enzyme in anderen, nicht Rosmarinsäure-haltigen Pflanzen erklären würde. Aus unterschiedlichen Pflanzen wurde eine Hydroxypyruvat Reduktase (HPR-2) beschrieben, die im Cytosol vorkommt, NADPH als Cofaktor benutzt und Hydroxypyruvat zu D-Glyoxylat reduziert. Von der HPR-2 sind bislang noch keine Sequenzen und auch keine Kristallstrukturen bekannt. Gegen diese Therorie spräche allerdings, dass die für dieses Enzym codierende mRNA aus Dunkel-Zellkulturen von C. blumei isoliert wurde. Im Dunklen sollte keine Photorespiration stattfinden und die an diesem Prozess beteiligten Enzyme sollten demnach auch nicht exprimiert werden. Weitere Untersuchungen müssten durchgeführt werden, um die Funktion des klonierten Enzyms eindeutig zu klären, aber erste Hinweise deuten auf eine mögliche Funktion des klonierten Enzyms als HPR-2.

Summary:
In this thesis a protein is characterised, which was formerly isolated from cell suspension cultures of Coleus blumei and identified as hydroxyphenylpyruvate reductase (Kim, 2004). Furthermore two crystal structures, one of the native protein and one complexed with NADP+, are presented in this work. Hydroxyphenylpyruvate reductase (HPPR) catalyses the reduction of hydroxyphenylpyruvates to the corresponding lactates. The enzyme is thought to be involved in the biosynthesis of rosmarinic acid in plants. After the putative HPPR cDNA was cloned and transformated into E. coli the protein was expressed by bacteria adding a His-Tag to the N-terminus of the protein. This His-Tag was used for purification of the H(P)PR. During characterisation of the putative H(P)PR some differences to the native protein were observed. The differences included a higher temperature optimum, different Km-values for the cosubstrates NADH and NADPH and most importantly differences in the substrate specificity. The Km-value for the proposed natural substrate 4-hydroxyphenylpyruvate (pHPP) with the native enzyme was determined as 10 and 80 µM respectively. For the same substrate the Km-value was 16.6 mM using the heterologously expressed H(P)PR. This is significantly higher compared to the values observed for the native enzyme. It should be mentioned that for pHPP substrate saturation could not be reached as high substrate concentrations could not be analysed by the available methods. For the heterologously expressed H(P)PR substrates that were better accepted than pHPP could be identified. The best accepted substrates were hydroxypyruvate with a Km-value of appr. 1 mM followed by glyoxylate with 2 mM. By determining two H(P)PR sequences from two Coleus blumei plants a mutation in the H(P)PR gene could be ruled out. As similar cDNAs/genes are known from different plants which do not produce rosmarinic acid as metabolite, doubts emerged if it is really the major role of the putative H(P)PR in vivo to be involved in rosmarinic acid biosynthesis. For further investigation two new protein sequences from two plants of the Solanaceae family were identified. Their amino acid sequence is 83.1% and 83.4% identical to the H(P)PR sequence. The protein was crystallised and two protein structures were determined. One is a structure of the native protein and in the other H(P)PR is complexed with NADP+. The overall structure shows the characteristic two-domain structure of the D-isomer-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase protein family. The smaller of the two domains is responsible for the binding of the substrate, whereas the other one binds the cosubstrate. The catalytic cleft is located between both domains. For other structures a flexibility of the domains was reported as the domains move towards each other after binding of substrate and/or cosubstrate. For the two H(P)PR structures no significant change in the opening angles was observed. Comparison with similar structures revealed high similarities to the structures of a D-glycerate dehydrogenase from bacteria and a human glycerate dehydrogenase/ hydroxypyruvate reductase although the similarities on the basis of nucleotide and amino acid sequences are rather low. This similarity could give first indication to the main in vivo role of the enzyme. As no crystal structure with substrate was achieved by co-crystallisation, several substrates were docked into the catalytic cleft. For large substrates with a phenyl ring no clear binding mode was observed. However for smaller substrates a distinct binding mode was indicated, which is consistent with substrate binding modes found for other D-isomer-specific 2-hydroxyacid dehydrogenases. The results obtained from enzyme characterisation and comparison with similar protein structures indicate a different main role of the enzyme in plants. Nevertheless, it should be emphasised that an involvement of the enzyme in rosmarinic acid biosynthesis as a side function is still conceivable. A possible main function could be the involvement in photorespiratory processes. This could explain the appearance of similar enzymes in plants, which do not accumulate rosmarinic acid as secondary metabolite. From other plants a cytosolic hydroxypyruvate reductase (HPR-2) was described, using preferably NADPH as cofactor to reduce hydroxypyruvate to D-glycerate. HPR-2 is thought to be involved in photorespiration. Unfortunately no sequences or crystal structures of the HPR-2 are known to date. However, this theory is not supported by the fact that the mRNA, which was used to establish the H(P)PR-cDNA, was isolated from cell cultures of Coleus blumei that were grown in the dark. It is not expected that photorespiration occurs in the dark. Therefore genes coding for proteins involved in this process should not be expressed. Further investigation is necessary to prove the in vivo role of the cloned enzyme but first characteristics indicate the enzyme being a putative HPR-2.


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