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Titel:Indentifizierung und Charakterisierung der katalytischen Untereinheit von Heterodisulfid-Reduktase aus methanogenen Archaea
Autor:Hamann, Nils
Weitere Beteiligte: Hedderich, Reiner (Dr.)
Veröffentlicht:2007
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2007/0677
DOI: https://doi.org/10.17192/z2007.0677
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2007-06774
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Identification and characterization of the catalytic subunit of heterodisulfide reductase from methanogenic archaea
Publikationsdatum:2008-01-25
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Methanogenesis, Iron-sulfur center, Heterodisulfid-Reduktase, Methanstoffwechsel, Archaea, Heterodisulfide reductase, Eisen-Schwefel-Zentrum, Archaebakterien

Zusammenfassung:
Heterodisulfid-Reduktase (Hdr) aus methanogenen Archaea katalysiert die reversible Reduktion des Heterodisulfids (CoM-S-S-CoB) aus Coenzym M (CoM-SH) und Coenzym B (CoB-SH), welches im letzten Schritt der Methanogenese neben Methan gebildet wird. CoM-Hdr ist ein paramagnetisches Intermediat, das durch die Halbreaktion von oxidiertem Enzym mit CoM-SH entsteht. Frühere spektroskopische Untersuchungen an CoM-Hdr deuteten auf das Vorliegen eines ungewöhnlichen [4Fe-4S]3+-Clusters im aktiven Zentrum des Enzyms hin, bei dem der Cluster mit CoM-SH als Ligand vorliegt. Bislang war nicht sicher, von welcher Hdr-Untereinheit das katalytische Zentrum gebunden wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Untereinheit HdrB des HdrABC-Holoenzyms aus Methanothermobacter marburgensis den [4Fe-4S]-Cluster des katalytischen Zentrums trägt. Dazu wurde die Produktion von HdrB in E. coli optimiert und das [4Fe-4S]-Zentrum in Zellextrakten mit HdrB chemisch in vitro rekonstituiert. Das im Durochinon-oxidierten Zustand erhaltene rhombische EPR-Signal mit gzyx = 2,015, 1,995 und 1,950 war dem von CoM-Hdr sehr ähnlich. Oxidation von HdrB in Gegenwart von CoM-33SH, verbreiterte sich das Signal, was die direkte Bindung von CoM-SH an das [Fe-S]-Zentrum zeigte. EPR-Redoxtitrationen ergaben eine Mittelpunktspotential-Verschiebung des Clusters um etwa 55 mV auf 175 mV ± 10 mV in Anwesenheit von CoM-SH. ENDOR-Spektroskopie mit 57Fe-angereichertem HdrB machte deutlich, dass in Abwesenheit von Substrat oxidiertes HdrB ein [4Fe 4S]-Zentrum enthielt, welches eine zu CoM-Hdr sehr ähnliche elektronische Struktur aufwies. HdrB besitzt zwei in der Pfam-Datenbank als CCG-Domäne annotierte Sequenzmotive mit jeweils fünf Cysteinyl-Resten (CX31-39CCX35-36CXXC). Mutagenese-Studien führten zur Identifizierung der vier Cysteinat-Liganden des [4Fe-4S]-Zentrums. Diese waren ausschließlich in der C terminalen CCG-Domäne von HdrB lokalisiert. XAS-Spektroskopie identifizierte in Hdr eine isolierte Zink-Stelle mit S3(N/O)1-Koordination, die ebenfalls in HdrB lokalisiert war. Auf Grundlage der erhaltenen Daten wurde ein neues Modell für den Katalyse-Zyklus von Hdr vorgeschlagen. Mit der Identifizierung von HdrB als katalytische Untereinheit von Hdr konnte erstmals die Funktion eines CCG-Domänen-Proteins gezeigt werden. Untersuchungen an Untereinheit SdhE von Succinat:Chinon-Oxidoreduktase vom Typ E aus Sulfolobus solfataricus gaben Hinweise auf das Vorliegen eines [4Fe-4S]-Zentrums bei einem weiteren CCG-Domänen-Protein mit offensichtlich anderen Funktionen und Eigenschaften als das in HdrB. Der mögliche evolutionäre Zusammenhang wird diskutiert.

Summary:
Heterodisulfide reductase (HDR) of methanogenic archaea with its active-site [4Fe-4S] cluster catalyzes the reversible reduction of the heterodisulfide (CoM-S-S-CoB) of the methanogenic coenzyme M (CoM-SH) and coenzyme B (CoB-SH). CoM-HDR, a mechanistic-based paramagnetic intermediate generated upon half-reaction of the oxidized enzyme with CoM-SH, is a novel type of [4Fe-4S]3+ cluster with CoM-SH as a ligand. Subunit HdrB of the Methanothermobacter marburgensis HdrABC holoenzyme contains two cysteine-rich sequence motifs (CX31-39CCX35-36CXXC), designated as CCG domain in the Pfam database and conserved in many proteins. Experimental evidence is presented that the C-terminal CCG domain of HdrB binds this unusual [4Fe-4S] cluster. HdrB was produced in Escherichia coli and an iron-sulfur cluster was subsequently inserted by in vitro reconstitution. In the oxidized state the cluster without the substrate exhibited a rhombic EPR signal (gzyx = 2.015, 1.995, and 1.950) reminiscent of the CoM-HDR signal. 57Fe ENDOR spectroscopy revealed that this paramagnetic species is a [4Fe-4S] cluster with 57Fe hyperfine couplings very similar to that of CoM-HDR. CoM-33SH resulted in a broadening of the EPR signal and upon addition of CoM-SH the midpoint potential of the cluster was shifted to values observed for CoM-HDR, both indicating binding of CoM-SH to the cluster. Site-directed mutagenesis of all 12 cysteine residues in HdrB identified four cysteines of the C-terminal CCG domain as cluster ligands. Combined with the previous detection of CoM-HDR-like EPR signals in other CCG domain–containing proteins our data indicate a general role of the C-terminal CCG domain in the coordination of this novel [4Fe-4S] cluster. In addition Zn K-edge X-ray absorption spectroscopy identified an isolated Zn site with an S3(O/N)1 geometry in HdrB and the HDR holoenzyme. The N-terminal CCG domain is suggested to provide ligands to the Zn site.


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