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Titel:Identification and analysis of Dictyostelium discoideum microtubule associated proteins
Autor:Koch, Katrin Veronika
Weitere Beteiligte: Bölker, Michael (Prof. Dr. )
Veröffentlicht:2006
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0802
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2006-08024
DOI: https://doi.org/10.17192/z2006.0802
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Identifizierung und Analyse von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen in Dictyostelium discoideum
Publikationsdatum:2006-12-21
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Dictyostelium discoideum, TACC, XMAP215, Tandem affinity purification, Centrosom, EB1, DdCP224, MAPs, Mikrotubulus

Summary:
The microtubule cytoskeleton and its dynamic ends are crucial for many cellular functions throughout the whole cell cycle. Microtubule associated proteins (MAPs) are known to interact with other proteins to fulfill these complex functions in balancing the dynamic instability of microtubules as well as anchoring microtubules at the cell cortex, guiding transport along them and controlling mitosis at the centrosome. Deficient function of these proteins leads to severe defects, including cancer. A major part of our understanding of these processes is knowing the proteins associated with the complexes at either end of microtubules. To identify new members of these complexes, interactors of well characterized and conserved proteins of the EB1 and XMAP215 family of MAPs were searched for in the model organism Dictyostelium discoideum. DdEB1 and the Dictyostelium member of the XMAP215 protein family, DdCP224, are known to be part of complexes at the microtubule tips as well as at the centrosome. DdCP224 is involved in centrosome duplication and cytokinesis, whereas DdEB1 assists in spindle formation. At the microtubule tip these two proteins are part of a complex that is thought to link microtubules to the cell cortex. In this study, two approaches were selected screen for novel interactors. Employment of the yeast two hybrid system yielded five putative interactors of DdEB1 and DdCP224 that could not be verified by other means. Tandem affinity purification (TAP) is a method originally established in yeast to isolate highly purified protein complexes in a very gentle and efficient way. In this study TAP was modified for Dictyostelium applications and proved to be a useful method to specifically isolate and identify microtubule-associated protein (MAP) complexes. Employing TAP and mass spectrometry the interaction between DdEB1 and DdCP224 was confirmed. Additionally, among several interactions that remain to be confirmed by other methods, an interaction between DdCP224 and a TACC-family protein could be shown for the first time in Dictyostelium and was confirmed by colocalization and co-immunoprecipitation analyses. Similar to findings in other species, the TACC domain is sufficient for the centrosomal localization of the protein and the interaction with the XMAP215 orthologue. Based on the results presented, DdTACC, the only member of this protein family present in Dictyostelium discoideum, was considered to be an essential gene product.

Zusammenfassung:
Das Microtubuli Zytoskelett mit seinen dynamischen Enden ist für viele Funktionen in der Zelle während des gesamten Zellzykluses unerlässlich. Dabei interagieren bekanntermaßen microtubuli-assoziierte Proteine (MAPs) mit anderen Proteinen um all die komplexen Aufgaben rund um die dynamische Instabilität der Mikrotubuli, die Verankerung der Mikrotubuli am Zellcortex, die Kontrolle der Mitose am Centrosom und die Leitung des Transports entlang der Mikrotubuli zu gewährleisten. Fehlfunktionen dieser Proteine führen zu gravierenden Defekten einschließlich Krebs. Die Kenntnis der an diesen Komplexen beteiligen Proteine macht hierbei einen Großteil unseres Verständnisses dieser Prozesse aus. Um bisher unbekannte Proteine, die zu diesen Komplexen gehören, zu identifizieren, wurde im Modelorganismus Dictyostelium discoideum nach Interaktoren von gut charakterisierten und konservierten Proteinen gesucht. Von DdEB1 und DdCP224, dem Vertreter der XMAP215 Proteine in Dictyostelium discoideum, ist bekannt, dass sie sowohl Teil des Komplexes an den Mikrotubuli-Plus-Enden als auch desjenigen am Centrosom sind. DdCP224 spielt bei der Centrosomenduplikation und der Zytokinese eine Rolle, DdEB1 hingegen ist an der Bildung der Mitosespindel beteiligt. An den Plus-Enden der Mikrotubuli sind diese beiden Proteine Teil des Komplexes, der die Mikrotubuli vermutlich mit dem Zellcortex verbindet. In dieser Arbeit wurden nun zwei Ansätze ausgewählt, um die Suche nach neuen Interaktoren aufzunehmen. Mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid Systems wurden fünf mögliche Interaktoren von DdEB1 und DdCP224 entdeckt, die nicht mit andere Methoden bestätigt werden konnten. Die sogenannte „Tandem affinity Purification“ (TAP), die ursprünglich in Hefe entwickelt wurde, stellt eine sehr sanfte und effiziente Methode dar, nach Proteininteraktionen zu suchen. Sie wurde in dieser Arbeit zur Nutzung in Dictyostelium discoideum angepasst und stellte sich als nützliche Methode zur spezifischen Isolation und Identifizierung Mikrotubuli assozierter Proteinkomplexe heraus. Mit Hilfe der TAP und den Methoden der Massenspektrometrie konnte im Rahmen dieser Arbeit die Interaktion zwischen DdEB1 und DdCP224 erneut bestätigt werden. Zusätzlich fanden sich weitere Interaktoren, von denen die zwischen einem Protein der TACC-Familie und DdCP224 erstmalig in Dictyostelium discoideum gezeigt werden konnte. Diese Interaktion wurde durch die Kolokalisierung und Koimmunprezipitation der beiden Proteine bestätigt. Ähnlich wie in anderen Organismen genügt auch in Dictyostelium discoideum die TACC-Domäne für die Lokalisation des Proteins am Centrosom und die Interaktion mit dem XMAP215 Orthologen. DdTACC stellt das einzige Mitglied dieser Proteinfamilie in Dictyostelium discoideum dar und scheint, wie die Ergebnisse dieser Arbeit nahelegen, essentielle Aufgaben zu besitzen.


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