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Titel:Identifizierung aktiver mikrobieller Populationen mit Hilfe stabiler Isotope
Autor:Schwarz, Julia Ingeborg Klara
Weitere Beteiligte: Conrad, Ralf (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2006
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0788
DOI: https://doi.org/10.17192/z2006.0788
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2006-07883
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Identification of active microbial populations by using stable isotopes
Publikationsdatum:2006-11-15
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Mikrobielle Diversität, Phylogenetic analysis, Seesediment, Methan, Mikrobieller Abbau, Microbial diversity, 16S rRNA gene, Freshwater sediment, Mikrobielle Gemeinschaft, Prokaryonten, T-RFLP-Analyse, Acetate, Phylogenetische Analyse, T-RFLP analysis, Ribosomale RNS <16S>

Zusammenfassung:
Prokaryoten spielen eine entscheidende Rolle am anaeroben Abbau und der Remineralisierung von sedimentiertem organischem Material in den anoxischen Sedimentschichten des Profundals von Süßwasserseen. Am Beispiel des Profundalsediments des See Genezareth wurde hier erstmalig durch die Kombination biogeochemischer und molekularbiologischer Methoden sowie den Einsatz 13C-markierter Substrate untersucht, welche Mikroorganismen am anaeroben Abbau von Algenbiomasse und Acetat beteiligt sind. Zunächst erfolgte die Charakterisierung der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft zu drei verschiedenen Probenahmezeitpunkten. Hierbei war die mikrobielle Gemeinschaft bezüglich ihrer Abundanz und Zusammensetzung sehr stabil. Die Abundanz der Bacteria und Archaea im Sediment wurde mittels quantitativer „real-time“-PCR anhand der Anzahl von 16S rRNA-Gen-Kopien bestimmt. Die prokaryotische Gemeinschaft wurde in hohem Maße von Bacteria dominiert. Die Zusammensetzung der bakteriellen und archaeellen Gemeinschaft wurde durch die molekulare Fingerabdruckmethode terminaler Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus kombiniert mit vergleichender Sequenzanalyse untersucht. Die bakterielle Gemeinschaft wies eine hohe phylogenetische Diversität auf, die viele bislang unkultivierte Arten umfasste. Sie wurde von Mitgliedern der Deltaproteobacteria und des Bacteroidetes-Phylums dominiert. Im Gegensatz zu den Bacteria waren die Archaea phylogenetisch weniger divers und wurden von hydrogenotrophen Methanomicrobiales und acetoklastischen Methanosaeta spp. dominiert. Bisher war nicht bekannt, wie die mikrobielle Gemeinschaft im Sediment eines Süßwassersees auf sedimentierendes organisches Material reagiert. Im See Genezareth erfolgt der größte Eintrag von organischem Material nach der alljährlichen Blüte der Alge Peridinium gatunense. Dieses Sedimentationsereignis wurde durch die Zugabe von P. gatunense-Zellen (nicht-markiert und 13C-markiert) zu anaerob inkubierten Sedimentaufschlämmungen simuliert. Während des anaeroben Abbaus der Algenbiomasse entstanden als zentrale Zwischenprodukte Acetat, Propionat und Wasserstoff. Der unmittelbare Anstieg der Acetat-, Propionat-, Wasserstoff-, Kohlendioxid- und Methankonzentrationen mit dem Start der Inkubation ließ eine schnelle Reaktion der mikrobiellen Gemeinschaft auf den Eintrag der Algenbiomasse erkennen. Diese Reaktion korrelierte mit zeitlichen Veränderungen in der Zusammensetzung ribosomaler RNA (16S rRNA) der aktiven bakteriellen und archaeellen Populationen. Nach eintägiger Inkubation wurden die aktiven Bacteria von den Deltaproteobacteria dominiert. Des Weiteren wurden Organismen aus dem Cluster I der Clostridia gefunden, das sowohl saccharolytische und proteolytische als auch fermentierende Bakterien umfasst. Nach sechs Tagen Inkubation wurden die aktiven bakteriellen Populationen durch ein verstärktes Auftreten biopolymerabbauender Mitglieder des Bacteroidetes-Phylums charakterisiert. Die Analyse der Sedimentaufschlämmungen mit 13C-markierter Algenbiomasse durch 16S rRNA-basiertes Stable-Isotope-Probing (RNA-SIP) deutete ebenfalls auf eine gesteigerte Aktivität Bacteroidetes-verwandter Bakterien zu diesem Zeitpunkt der Inkubation hin. Die Zugabe der 13C-Algenbiomasse führte auch zu einer geringfügigen 13C-Anreicherung archaeeller 16S rRNA. Außerdem ließen die Abnahme der Acetatkonzentration, eine erhöhte Methanproduktionsrate und die Zunahme der relativen Abundanz von Methanosaeta spp. auf eine Aktivierung acetoklastischer Methanogener schließen. Um Einblicke in die Umsetzung von Acetat, dem bedeutendsten Zwischenprodukt im anaeroben Abbau der Algenbiomasse, zu gewinnen, wurde der respiratorische Index (RI) für die Umsetzung von [2-14C]-Acetat bestimmt. Der RI zeigte, dass mehr als 80% des Acetats durch acetoklastische Spaltung zu Methan umgesetzt und nur ein geringerer Anteil zu Kohlendioxid oxidiert worden war. Zur Identifizierung der aktiv an diesen Prozessen beteiligten Mikroorganismen wurden Sedimentaufschlämmungen mit [U-13C]-Acetat inkubiert (RNA-SIP). Die Analyse der 13C-markierten 16S rRNA zeigte, dass es zu einer starken Aktivierung archaeeller Populationen kam und Methanosaeta spp. für die acetoklastische Spaltung des Acetats verantwortlich waren. Obwohl nur ein geringer Anteil der Bacteria die 13C-Markierung in ihre RNA inkorporiert hatte, ermöglichte RNA-SIP die Identifizierung dieser Bakterien. Die aktivsten wurden der Thermodesulfovibrio-„Magnetobacterium“-Gruppe innerhalb des Nitrospira-Phylums zugeordnet. Weitere waren mit den Nitrosomonadales, den Burkholderiales und den Rhodocyclales innerhalb der Betaproteobacteria verwandt. Insgesamt vertiefte diese Arbeit das Verständnis der Funktion mikrobieller Gemeinschaften in diesem Habitat. Neben der Charakterisierung der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft eines Süßwasserseesediments konnten in dieser Arbeit Bacteria und Archaea identifiziert werden, die aktiv am anaeroben Abbau von Algenbiomasse und Acetat beteiligt waren.

Summary:
The microbial community of freshwater sediments plays a crucial role in the degradation and transformation of organic matter. In this study, microorganisms involved in the anaerobic degradation of algal biomass and acetate in the profundal sediment of Lake Kinneret were identified for the first time by applying a combination of biogeochemical and molecular methods as well as by using 13C-labelled substrates. First, the microbial community structure of three independent sediment samples was analysed by culture-independent molecular methods. Species composition and relative abundance of the overall microbial community turned out to be very stable. The numbers of Archaea and Bacteria, quantified by real-time PCR targeting 16S rRNA genes, showed that Bacteria account for the larger fraction of the total prokaryotic community. Species composition of the bacterial and archaeal community was analysed by terminal restriction fragment length polymorphism and comparative sequence analysis. The bacterial community showed a high phylogenetic diversity, comprising a lot of yet uncultivated species. It was dominated by members of the Deltaproteobacteria and the Bacteroidetes phylum. In contrast to Bacteria, Archaea were phylogenetically less divers und were dominated by hydrogenotrophic Methanomicrobiales and acetoclastic Methanosaeta spp.. Until now it was unknown, how microbial communities of profundal lake sediments react to the input of organic material. In Lake Kinneret the highest input of organic material occurs after the annual bloom and sedimentation of the algae Peridinium gatunense. This sedimentation event was simulated by addition of P. gatunense cells (unlabelled and 13C-labelled) to anaerobic sediment slurries. Acetate, Propionate and H2 were formed as key intermediates during the anaerobic degradation of the algal biomass. Immediate accumulation of acetate, propionate, H2, CO2 and CH4 with the onset of the incubation indicated a fast reaction of the microbial community to the input of algal biomass. This response correlated with temporal shifts in the composition of ribosomal RNA (16S rRNA) of active bacterial and archaeal populations. After one day of incubation active Bacteria were dominated by Deltaproteobacteria. Additionally, members of Clostridia Cluster I were detected. This Cluster I contains saccharolytic and proteolytic as well as fermentative bacteria. However, after six days of incubation active bacterial populations were characterized by the occurrence of members of the Bacteriodetes phylum, which are known as degraders of biopolymers. This was continued by analysis of sediment slurries incubated after addition of 13C-labelled algal biomass by 16S rRNA-based stable-isotope probing (RNA-SIP) that indicated an enhanced activation of Bacteriodetes-related bacteria at that time. Furthermore, addition of algal biomass resulted in a slight 13C-enrichment of archaeal 16S rRNA. More specifically, a decrease in the concentration of acetate, an increased methane production rate and an increase in the relative abundance of Methanosaeta spp. suggested an activation of acetoclastic methanogens. To get insights into the conversion of acetate as the most important intermediate in anaerobic degradation of the algal biomass the respiratory index (RI) for the conversion of [2-14C]acetate was determined. RI values showed that more than 80% of the acetate added was converted to methane by acetoclastic cleavage but only a minor fraction was oxidized to CO2. To identify microorganisms involved in these processes sediment slurries were incubated with [U-13C]acetate (RNA-SIP). Subsequent analysis of the 13C-labelled RNA showed a strong activation of archaeal populations and that Methanosaeta spp. was responsible for the degradation of acetate by acetoclastic cleavage. Although only a minor part of the Bacteria incorporated the 13C-label into their RNA, RNA-SIP could identify those bacteria. Most of the active Bacteria were affiliated with members of the Thermodesulfovibrio-„Magnetobacterium“-group of the Nitrospira phylum and also with Nitrosomonadales, Burkholderiales and Rhodocyclales within the Betaproteobacteria. In summary, our study provides a comprehensive insight into the function of microbial communities in this habitat. Besides the characterization of the total microbial community of a profundal lake sediment, we identified Bacteria and Archaea actively involved in the anaerobic degradation of algal biomass and acetate.


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