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Titel:Identifizierung von Effektoren der Pheromon-MAPK-Kaskade in Ustilago maydis
Autor:Brefort, Thomas
Weitere Beteiligte: Kahmann, Regine (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2004
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2005/0061
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2005-00614
DOI: https://doi.org/10.17192/z2005.0061
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Identification of effectors of the pheromone MAP kinase cascade in Ustilago maydis
Publikationsdatum:2005-03-08
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
phytopathogener Pilz, HMG-Box, Pheromonantwort, MAP-Kinase, HMG-box, Phytopathogene Pilze, Phytopathogenic fungus, Ustilago maydis, Signaltransduktion, HMG-Proteine, Mating, MAP-kinase, Ustilago zeae, MAP-Kinase, Ustilago maydis

Zusammenfassung:
Die sexuelle Entwicklung von Ustilago maydis, dem Erreger des Maisbeulenbrandes, wird durch die Fusion zweier haploider Sporidien eingeleitet. Das aus der Zellfusion hervorgehende Dikaryon ist dann in der Lage die Maispflanze zu infizieren. Diese Entwicklungsprozesse werden durch die beiden Paarungstyploci a und b kontrolliert. Der biallelische a-Locus kodiert für ein Pheromon-Pheromonrezeptorsystem, das die Zell-Zellerkennung und die anschließende Zellfusion gewährleistet. Der multiallelische b-Locus kodiert für zwei Homeodomänenproteine, bE und bW, die nur in bestimmten Kombinationen heterodimerisieren und weitere Entwicklungsschritte ermöglichen. Während der Zell-Zellerkennung induziert das Pheromonsignal die Ausbildung von Konjugationshyphen und die Transkription der a- und b-Paarungstypgene. Die Induktion der a- und b-Gene erfolgt über den Transkriptionsfaktor Prf1, der über den cAMP-Signalweg und das Pheromon-MAPK-Modul posttranskriptionell aktiviert wird. Das aktive MAPK-Modul induziert zusätzlich die Transkription von prf1 und ist außerdem für die Ausbildung der Konjugationshyphen verantwortlich. Prf1 wird für die Konjugationshyphenbildung jedoch nicht benötigt. Diese Ergebnisse früherer Arbeiten deuteten auf die Existenz von weiteren unterhalb des MAPK-Moduls agierenden Regulatoren der Pheromonantwort hin. In dieser Arbeit wurden mit Rop1 und Hmg3 zwei HMG-Domänen-Transkriptionsfaktoren identifiziert, die wie Prf1 zur sequenzspezifisch DNA-bindenden Klasse dieser Proteinfamilie gehören. Während hmg3-Deletionsmutanten zwar einen schwachen Zellfusions- und Pathogenitätsdefekt zeigten, jedoch nach Pheromonstimulation Konjugationshyphen bildeten und lediglich eine leicht reduzierte Expression des Pheromongens aufwiesen, führte die Deletion von rop1 zum Verlust der Pheromon-induzierten Genexpression sowie der Konjugationshyphenbildung. Weitere Untersuchungen zeigten, dass rop1 selbst in Stämmen, die eine konstitutiv aktive Variante der MAPKK Fuz7 exprimieren für die Transkription von prf1 sowie die a- und b-Genexpression erforderlich ist. Dieser Ansatz ergab auch, dass rop1 an der Ausbildung von Konjugationshyphen nur indirekt beteiligt ist. Desweiteren wurden die starken Zellfusions- und Filamentationsdefekte von Drop1-Stämmen durch die konstitutive Expression von prf1 komplementiert, was darauf hindeutete, dass Rop1 einen entscheidenden Regulator der prf1-Expression darstellt. Gelretardationsexperimente ergaben dann, dass Rop1 in vitro spezifisch an den prf1-Promotor bindet und ermöglichten ferner die Identifizierung eines DNA-Bindemotivs, das sich in einer Reihe weiterer putativer Promotorregionen des U. maydis Genoms findet. In Northern-Analysen konnte gezeigt werden, dass das genetisch aktivierte MAPK-Modul die rop1-Expression über die MAPK Kpp2 induziert. Im Gegensatz dazu führte die genetische Aktivierung des cAMP-Signalweges zur Repression der rop1-Expression. Überraschenderweise exprimierten rop1-Deletionsmutanten auf der Pflanzenoberfläche ausreichend prf1, um alle Entwicklungsstadien zu durchlaufen und volle Pathogenität zu entwickeln. Dies deutet auf die Existenz von zusätzlichen Regulatoren der prf1-Expression auf der Pflanze hin.

Summary:
In the phytopathogenic fungus Ustilago maydis, the causative agent of corn smut disease, sexual development is initiated by the fusion of two compatible haploid sporidia. The resulting filamentous dikaryon is then able to infect the host plant maize. These processes are genetically controlled by the two mating type loci a and b. The biallelic a-locus encodes a pheromone/ pheromone receptor system, which controls cell-cell recognition and fusion of compatible sporidia. Subsequent filamentous growth and pathogenic development are regulated by the multiallelic b-locus. This locus codes for two homeodomain proteins, bE and bW, which heterodimerize to generate an active transcription factor when derived from different alleles. During cell-cell recognition the pheromone signal triggers the formation of conjugation hyphae and the enhanced expression of the a- and b- mating type genes. Basal as well as pheromone-induced expression of these genes require the HMG domain transcription factor Prf1. Consequently, prf1 deletion mutants are sterile and non-pathogenic. To perform its function Prf1 needs to be activated by a conserved cAMP-cascade and a conserved MAP kinase module. Both pathways activate Prf1 on the post-transcriptional level. In addition, activation of the MAP kinase cascade results in the elevated transcription of prf1 and triggers the formation of conjugation hyphae. Interestingly, previous studies have shown that prf1 is dispensable for this morphological transition. These results pointed towards the existence of additional effectors of the pheromone MAP kinase cascade in U. maydis. In this thesis, rop1 and hmg3 encoding two additional HMG domain transcription factors were identified. Like Prf1, they belong to the sequence-specific class of this protein family. While hmg3 deletion strains are slightly impaired in mating and pathogenicity and show reduced expression of the pheromone gene, these strains developed conjugation hyphae in response to pheromone. In contrast to that the deletion of rop1 results in a complete loss of pheromone-induced gene expression and conjugation hyphae formation. Analyses of strains that express a constitutively active variant of the pheromone MAPK kinase Fuz7 showed that rop1 is still required for the transcription of prf1 and prf1-induced genes when the need for the perception of a pheromone signal is bypassed. This approach also indicated that rop1 affects conjugation tube formation only indirectly. Since constitutive expression of prf1 complements the mating and conjugation defects of rop1 deletion strains, rop1 appeared to be an essential regulator of prf1 gene expression. Indeed, electrophoretic mobility shift assays demonstrated that Rop1 directly binds to the prf1 promoter in vitro and led to the identification of a specific DNA binding motif, which is present in a number of additional putative promoter regions of the U. maydis genome. Furthermore, Northern analyses revealed that rop1 gene expression is positively regulated by the pheromone MAP kinase cascade, while active cAMP signalling represses rop1 transcription. Surprisingly, on the plant surface rop1 deletion strains do form conjugation hyphae and express sufficient prf1 to cause full pathogenicity. This indicates the involvement of addititional components in the regulation of prf1 gene expression during pathogenic growth.


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