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Titel:4’-Phosphopantethein Transfer in Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa sowie Grundlagen zur gerichteten Proteinevolution von Adenylierungsdomänen der Nichtribosomalen Peptidsynthetasen
Autor:Finking, Robert
Weitere Beteiligte: Marahiel, Mohamed A. (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2003
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2003/0645
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2003-06451
DOI: https://doi.org/10.17192/z2003.0645
DDC:540 Chemie
Titel(trans.):4’-Phosphopantetheine Transfer in Bacillus subtilis And Pseudomonas aeruginosa as Well as Preparatory Work for Directed Protein Evolution of Adenylation Domains of Nonribosomal Peptide Synthetases
Publikationsdatum:2003-11-11
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Nichtribosomale Peptidsynthetase, Peptidyl Carrier Protein, Peptidyl Carrier Protein, Adenylierungsdomäne, nonribosomal peptide synthease, 4'-Phosphopantetheine transferase, Acyl Carrier Protein, 4'-Phosphopantethein Transferasen, adenylation domain, Acyl Carrier Protein, Enzyminhibitor, Biochemische Analyse

Zusammenfassung:
Carrier Proteine (CP) werden in unterschiedlichen prokaryontischen und eukaryontischen Synthesesystemen als Transporteinheiten für die Syntheseintermediate eingesetzt. Im Primärmetabolismus dienen sie zum Transport von Acyleinheiten (Fettsäuresynthese) und D-Ala (Modifikation der Zellwand). Im Sekundärmetabolismus werden sie zur Beförderung von Aminoacyl/Peptidyl/Aryleinheiten (nichtribosomale Peptidsynthetasen, NRPS) und Ketoacyleineheiten (Polyketidsynthasen) eingesetzt. Die Intermediate werden am 4’-Phosphopantethein-Cofaktor (4’PP) des CP als Thioester gebunden. Der 4’PP-Cofaktor wird posttranslational von Coenzym A auf einen konservierten Serinrest des CP übertragen, katalysiert durch sog. 4’PP-Transferasen (PPTasen). E. coli besitzt zwei PPTasen. Die Acyl Carrier Protein Synthase (AcpS) modifiziert nur die CP des Primärmetabolismus, während EntD nur die CP des Sekundärmetabolismus bedient. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die beiden PPTasen von B. subtilis, AcpS und Sfp, überlappende Spezifitäten besitzen. Es zeigte sich, dass AcpS lediglich die CP des Primärmetabolismus modifiziert, während Sfp, das zwar alle CP erkennt, jedoch deutliche Präferenz für die CP des Sekundärmetabolismus hat. In P. aeruginosa wurde nur eine PPTase, PcpS, gefunden. Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften ist PcpS eine PPTase des Sekundärmetabolismus. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass sie, wie Sfp, alle CP modifizieren kann, jedoch evolutiv auf die Modifikation der CP des Primärmetabolismus optimiert wurde. Eine Deletion des zugehörigen Gens und RNA-interference zeigten, dass diese PPTase für P. aeruginosa essentiell ist. Weitere Untersuchung zur CP-PPTasen-Erkennung konnten außerdem die Interaktionsstelle zwischen beiden Proteinen aufdecken. Die Inhibierung der Adenylierungsdomänen (A-Domänen) der NRPS, die für die Selektion des Aminosäuresubstrats verantwortlich sind, durch Aminoacyl-Sulfamoyl Adenylatanaloga konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich auf eine A-Domäne des Primärmetabolismus übertragen werden. Ein Modifikation dieser Inhibitoren mit einem Linker erlaubt ihre Bindung an eine Matrix. Der Linker beeinflusst die inhibitorischen Eigenschaften z.T. nicht und kann den Einsatz dieser linkermodifizierten Inhibitoren zur gerichteten Proteinevolution von A-Domänen ermöglichen. Außerdem wurde zum Zweck der Evolution von A-Domänen ein Screeningsystem entwickelt. Dieses System basiert auf der in vivo beobachtbaren Lumineszenz der Luciferase. Damit kann eine A-Domänenbibliothek auf veränderte Selektivität in Richtung des Substrats der Luciferase, Luciferin, durchmustert werden.

Summary:
Carrier Proteins (CPs) function as transport units for intermediates in a number of different prokaryotic and eukaryotic machineries. In primary metabolism, CP are used to transport acyl units (fatty acid synthesis) or D-Ala (modification of the bacterial cell wall) whereas in secondary metabolism they serve as transporters for aminoacyl/peptidyl/aryl-units (nonribosomal peptide synthetases, NRPS) and ketoacyl units (polyketide synthases). Intermediates are generally bound as thioesters to the 4’-phosphopantetheine cofactor (4’PP) of the CP. The 4’PP cofactor is transferred posttranslationally from Coenzyme A to a conserved serine residue of the CP, catalyzed by so-called 4’PP-transferases (PPTases). E. coli harbors two PPTases. The Acyl Carrier Protein Synthase (AcpS) modifies solely the CP of primary metabolism, whereas EntD recognizes only the CPs of secondary metabolism. This work revealed that the two PPTases of B. subtilis, AcpS and Sfp, exhibit overlapping selectivity: while AcpS recognizes only the CPs of primary metabolism, Sfp modifies all CPs present, albeit with an obvious preference for those of secondary metabolism. Only one open reading frame encoding a PPTase, PcpS, was found in the genome of P. aeruginosa. According to its physical characteristics, PcpS is a PPTase of secondary metabolism. Biochemical characterization of PcpS revealed, however, that it, like Sfp, modifies all types of CPs but was evolutionary optimized for the modification of CPs of primary metabolism. Deletion of the corresponding gene and RNA-interference showed that this PPTase is essential for P. aeruginosa. Further characterization of the CP-PPTase recognition threw light on the mode of interaction of the two proteins. The concept of inhibition of adenylation domains (A-domains) of NRPS, which are responsible for the selection of the amino acid substrate, by aminoacyl-sulfamoyl adenylate analogues was successfully transferred to an A-domain of primary metabolism. Modification of these inhibitors with a linker enables binding to a matrix. In general, the linker had no influence on the inhibitory properties of these molecules and may allow their usage in directed protein evolution of A-domains. In addition, a screening system for the evolution of A-domains was developed that relies on the luminescence of the enzyme Luciferase which can be followed in vitro. This system allows screening of an A-domain library for changed selectivity towards the substrate of Luciferase, namely Luciferin.


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