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Biochemische und kristallographische Charakterisierung der eukaryotischen tRNA-Guanin-Transglykosylase (TGT)
Im Rahmen dieser Arbeit konnte ausgehend von den bereits bekannten Präparationsbedingungen der beiden separaten Untereinheiten der Maus-TGT ein Expressions- sowie ein Reinigungsprotokoll für die gemeinsame Präparation des funktionalen TGT-Heterodimers der Maus etabliert werden. Dazu wurde zunächst e...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2023
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Im Rahmen dieser Arbeit konnte ausgehend von den bereits bekannten Präparationsbedingungen der beiden separaten Untereinheiten der Maus-TGT ein Expressions- sowie ein Reinigungsprotokoll für die gemeinsame Präparation des funktionalen TGT-Heterodimers der Maus etabliert werden. Dazu wurde zunächst ein Expressionsvektor auf der Basis eines pETDuet-Vektors konstruiert. Da sich mehrere E. coli-Stämme als ungeeignet erwiesen, wurde schließlich eine Expressionsvorschrift unter Verwendung eines V. natriegens-Stamms entwickelt. Die Entfernung von Nukleinsäure-Verunreinigungen unter Erhalt des auf nicht-kovalenten Wechselwirkungen basierenden Protein-Protein-Kontakts des Heterodimers stellte dabei die größte Herausforderung dar. Dieses Problem konnte schließlich mit einer Kombination einem zusätzlichen Waschschritt mit einem Lithiumchlorid-haltigen Puffer im Rahmen der Affinitätschromatographie sowie einer Phenyl-Sepharose™-Matrix gelöst werden.
In Zusammenarbeit mit dem MarXtal-Labor des Fachbereichs Chemie der Universität Marburg konnten mehrere initiale Kristallbedingungen identifiziert werden, die teilweise das Polyoxometallat TEW beinhalteten. Sämtliche initiale Bedingungen wurden inhouse reproduziert und im Falle einer erfolgreichen Reproduktion einer Optimierungsstudie unterzogen. Die Struktur des QTRT1/2-Heterodimers konnte schließlich in Ab- und Anwesenheit des Additivs TEW de novo gelöst werden. In beiden Fällen lässt sich wie auch in der Kristallstruktur der QTRT1-Untereinheit die α Helix 0 beobachten. Das deutet darauf hin, dass es sich bei dem Strukturelement nicht um ein kristallographisches Artefakt handelt, sondern in Abwesenheit von tRNA auch unter physiologischen Bedingungen ausgebildet wird.
Anhand der TEW-Bedingung konnte auch eine Struktur in Komplex mit Queuin durch Ko-Kristallisation erhalten werden. Da die Citrat-haltige Bedingung ohne TEW aufgrund eines im aktiven Zentrum gebundenen Citrat-Moleküls ohne Weiteres nicht für das Soaking geeignet ist, wurde eine Methode entwickelt, um das aktive Zentrum im ersten Schritt freizulegen und einen Liganden im zweiten Schritt durch Soaking in das aktive Zentrum einzubringen. So konnte die Bindungspose von Queuin in der Bindetasche der QTRT1 durch den Vergleich zweier unterschiedlicher Methoden, Ko-Kristallisation und Soaking, bestätigt werden.
In der Kristallstruktur der Maus-TGT im Komplex mit Queuin ließen sich Van-der-Waals Kontakte zwischen Val161 der QTRT1 und dem 7-Deazapuringerüst sowie dem Dihydroxycyclopenten-Rest von Queuin beobachten. Val161 ist in den meisten bakteriellen TGTs durch Cystein ausgetauscht. Zudem wird durch das Fehlen einer Seitenkette bei Gly232 genug Platz für den großvolumigen Dihydroxycyclopenten-Rest in der Bindetasche der QTRT1 geschaffen. In mehr als 90 % der bakteriellen TGTs ist dieses Glycin durch Valin ausgetauscht. Dadurch tragen beide Aminosäuren zur Substratspezifität der eukaryotischen TGT bei.
Die enzymkinetischen sowie massenspektrometrischen Untersuchungen haben gezeigt, dass die Mutation von Tyr 354 der QTRT2 zu Phenylalanin zu einer signifikanten Destabilisierung des QTRT2-Homodimers führt. Dies führt zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zum funktionellen Heterodimer. Vermutlich hat die Mutation auch eine Auswirkung auf das funktionelle Heterodimer, allerdings in geringerem Ausmaß. Die Mutation von Ser 41 sowie Tyr 354 der QTRT2 führt zudem zu einer geringeren Umsatzrate des Heterodimers.
Anhand der enzymkinetischen Studien wurde gezeigt, dass durch die Adressierung der Ribose33-Bindetasche durch großvolumige Reste eine Selektivität zwischen der bakteriellen und eukaryotischen TGT erzielt werden kann. Inhibitoren mit lin-Benzoguanin-Grundgerüst, welche an Position 2 substituiert waren, zeigten nämlich kaum eine Hemmung der eukaryotischen TGT, während sie die bakterielle TGT teils im einstelligen nanomolaren Bereich hemmen. Neben ausgewählten Inhibitoren wurden auch einige bekannte Substrate der eukaryotischen TGT enzymkinetisch charakterisiert. Abschließend konnte ein Reaktionsmechanismus postuliert werden, welcher den irreversiblen Einbau von Queuin, preQ1 und 7-Deazaguanin erklärt. Ein irreversibler Einbau findet immer dann statt, wenn die durch den nukleophilen Angriff der Seitenkette des Asp279 auf das C1-Atoms des Ribosezuckers entstehende negative Ladung nicht durch das Substrat in Position 34 stabilisiert werden kann. |
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| DOI: | 10.17192/z2023.0527 |