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MELICOMO - Metabolic Engineering mit lichtkontrollierten Modulen
Im Jahr 2018 wurden zum ersten Mal, von Zhao et al, optogenetische Module zur Regulation von biotechnologischen Produktionen verwendet. Mit Hilfe der Optogenetik wurde erfolgreich, zwischen einer Wachstums- und Produktionsphase, lichtinduziert geschaltet. Diese ersten Konstrukte stellten sich als äu...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2021
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Im Jahr 2018 wurden zum ersten Mal, von Zhao et al, optogenetische Module zur Regulation von biotechnologischen Produktionen verwendet. Mit Hilfe der Optogenetik wurde erfolgreich, zwischen einer Wachstums- und Produktionsphase, lichtinduziert geschaltet. Diese ersten Konstrukte stellten sich als äußerst vielversprechend dar, fokussierten sich jedoch hauptsächlich auf eine Kontrolle des heterologen Biosyntheseweges. Um die Biotechnologie lückenlos, als Anwendungsgebiet der Optogenetik, zu erschließen, fehlten Stammoptimierungen.
In dieser Arbeit wurden optogenetische Schalter, für „Metabolic Engineering“, in Saccharomyces cerevisiae entwickelt und angewendet. Durch die Kombination einer lichtinduzierten Transkriptionsregulation und einem photosensitiven Degron (psd), gelang es, einen ultrasensitiven Schalter zu generieren. Diese synergistische, optogenetische und mehrstufige Kontrolle (SOMCo) ermöglicht eine komplette Aktivitätskontrolle auch bei sehr geringen Lichtinstensitäten. Ein Vergleich mit dem gut charakterisierten ADH1-Promotor erlaubt es zukünftig noch leichter weitere Anwendungsgebiete zu finden. Zusätzlich wurde zum ersten Mal die Auswirkung einer lichtregulierten PKA-Aktivität auf heterologe Biosynthesewege untersucht. Hierfür wurden verschiedene Konstrukte der blaulichtregulierten Adenylylcyclase bPAC und eine Fusion der nativen Adenylylcyclase Cyr1 mit einem photosensitiven Degron verwendet und charakterisiert.
Diese unterschiedlichen Regulationsmodule ermöglichten es erste heterologe Prozesse zu verbessern. Durch Stammoptimierungen, mit den entwickelten und charakterisierten optogenetischen Konstrukten, konnte erfolgreich eine erhöhte β-Carotin, Cordycepin- und Betulinsäureproduktion erreicht werden.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Generieren eines Gibberellinsäure 4 produzierenden S. cerevisiae Stammes. Hierfür mussten insgesamt 8 heterologe Gene implementiert werden. Um die erfolgreiche Produktion in vivo verfolgen zu können, wurde ein Reporter, basierend auf der GA abhängige Interaktion von AtGAI und AtGid1A, entwickelt. Um diese Interaktion zu visualisieren, wurden die einzelnen Komponenten mit splitVenus-Sequenzen fusioniert, welche durch die entstehende Wechselbeziehung reassemblieren. Mit Hilfe dieses entwickelten „Gibberellic Acid Venus“-Reporters (GAVR), ließen sich unterschiedliche GA3-Konzentrationen im Medium bestimmen. Zusätzlich lieferte GAVR in dem neuen GA4 produzierenden „Proof-of-Principle“ Stamm erste Hinweise auf eine erfolgreiche Produktion.
Während dieser Arbeit konnte durch die Entwicklung von neuen lichtabhängigen Modulen, wie SOMCo, den neuen bPAC-Konstrukten und dem GA-Reporter, der optogenetische Werkzeugkasten erweitert werden. Es konnte erfolgreich die heterologe Produktion von β Carotin aus FPP, Betulinsäure aus 2,3-Oxidosqualen und Cordycepin aus 3’AMP erhöht und die GA4-Produktion aus FPP visualisiert werden. Dies wurde durch photosensitive Proteindegradation, der Steuerung einer zentralen Proteinkinase durch Blaulicht und einem fluoreszierenden Reporter für ein spezifisches Produkt ermöglicht. Durch erfolgreiche Anwendungen dieser optogenetischen Module ließ sich die Biotechnologie als Anwendungsgebiet der Optogenetik weiter erschließen. |
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| Umfang: | 137 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2021.0084 |