Untersuchungen zur selektiven Erkennung von G-Proteinen durch GPCRs und ihrer nachgeschalteten Aktivierung mittels Mutagenesestudien

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden mit ca. 800 verschiedenen Individuen die größte Rezeptorgruppe des menschlichen Genoms und sind die Zielstruktur von ca. 30% aller zugelassenen Medikamente. Sie binden vielfältige extrazelluläre Liganden, wie z.B. Neurotransmitter oder Hormone, um Signa...

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Main Author: Jelinek, Volker
Contributors: Bünemann, Moritz (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
Pharmakologie und Toxikologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden mit ca. 800 verschiedenen Individuen die größte Rezeptorgruppe des menschlichen Genoms und sind die Zielstruktur von ca. 30% aller zugelassenen Medikamente. Sie binden vielfältige extrazelluläre Liganden, wie z.B. Neurotransmitter oder Hormone, um Signale ins Zellinnere weiterzuleiten, ohne dass die Liganden selbst die Zellmembran überwinden müssen. Je nachdem an welche der vier verschiedenen Klassen heterotrimerer G-Proteine GPCRs intrazellulär koppeln, werden spezifische physiologische Vorgänge in einer Zelle ausgelöst. Daher ist das Verständnis des Mechanismus der selektiven G-Protein-Erkennung und Kopplung durch GPCRs von zentraler Bedeutung. Kürzlich veröffentlichte Strukturen von GPCR-G-Protein-Komplexen haben das Wissen, wie GPCRs mit G-Proteinen interagieren, zwar deutlich erweitert, jedoch sind sie nur Momentaufnahmen, die nicht die zeitliche Abfolge des mehrstufigen Kopplungsprozesses abbilden können. Außerdem konnten sie keine spezifischen Interaktionsstellen zwischen GPCRs und bestimmten Gα-Unterfamilien enthüllen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden daher FRET-Experimente in lebenden Zellen durchgeführt, um die Subtyp-spezifischen Eigenschaften vielfältiger Gq- und Go-basierter Gα-Chimären zu untersuchen, die für die selektive Bindung und Aktivierung durch M3- (M3R) und H1-Rezeptoren (H1R) verantwortlich sind. Dazu wurden die relativen Bindungsstabilitäten von Gα-Chimären an Rezeptoren in permeabilisierten Zellen bestimmt, indem die Dissoziationskinetiken der Gα-Chimären vom M3R und H1R unter Nukleotid-freien Bedingungen miteinander verglichen wurden. Außerdem wurden die Aktivierungspotenzen der Gα-Chimären in lebenden Zellen durch Auswerten von Konzentrations-Wirkungskurven analysiert, die letztlich die für die Signalweiterleitung relevante Kopplungseffizienz widerspiegeln. Für beide Rezeptoren konnten wir zeigen, dass sowohl die Bindungs- als auch die Aktivierungscharakteristiken von dafür essenziellen Gα-Strukturen, wie dem αN/β1-Loop, dem β2/β3-Loop und der α5-Helix, von einer G-Protein-Klasse auf eine andere übertragen werden konnten. Diese Strukturen unterschieden sich außerdem in ihren Auswirkungen auf die selektive Bindung und die nachfolgende Aktivierung, je nachdem welcher Rezeptor beteiligt war. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zusätzlich strukturelle Elemente im Rezeptor hinsichtlich ihres Einflusses auf die Kopplungsselektivität untersucht. Erste Versuche, die Kopplungseigenschaften vom M3R gegenüber Gq- oder Go-Proteinen durch Punktmutationen grundlegend zu verändern, waren jedoch nicht erfolgreich. Deshalb wurde der ganze dritte intrazelluläre Loop (ICL3) des M3Rs herausgeschnitten, jedoch hatte dies ebenfalls keine Auswirkungen auf die Bindungsstabilität von Gq- und Go-Proteinen. Wurde im Gegensatz dazu aber der ICL3 des M3Rs mit dem des verwandten, aber ausschließlich Gi/o-koppelnden M2Rs ersetzt (M3ICL3M2), erhöhte sich die Stabilität der Bindung von Gαo. Zuletzt wurde die Bedeutung der Helix 8 für die Selektivität der G-Protein-Kopplung untersucht, indem weitere Chimären zwischen M3R und M2R kloniert wurden. Das führte bei der M3R-basierten M3H8M2-Chimäre zu einem kompletten Kopplungsverlust gegenüber Gαo, obwohl der M2R mit derselben Helix 8 problemlos an Gi/o-Proteine binden kann. Im Einklang mit diesem Ergebnis war die Bindungsstabilität von Gαo an der umgekehrten M2H8M3-Chimäre deutlich erhöht und sogar die Kopplung von Gq wurde trotz des M2R-Grundgerüstes ermöglicht. Insgesamt bietet diese Arbeit neuartige Einblicke in die molekularen Grundlagen der Kopplungsselektivität zwischen verschiedenen Rezeptoren und G-Proteinen.
Physical Description:148 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2020.0530