Inaktivierung von mRNAs und miRNAs durch DNA/LNA-basierte und mit zusätzlichen Funktionalitäten konjugierte Antisense-Oligonukleotide

Seit der Entdeckung der RNA Interferenz (RNAi) Ende der 90er Jahre wurde dieser Mechanismus als gentechnisches Werkzeug stetig weiterentwickelt und in den verschiedensten biologischen sowie medizinischen Bereichen eingesetzt. Dies ermöglichte nicht nur die Aufklärung unbekannter Gen-Funktionen durch...

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Main Author: Thomas, Laura
Contributors: Hartmann, Roland K., (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
Pharmazeutische Chemie
Subjects:
LNA
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Seit der Entdeckung der RNA Interferenz (RNAi) Ende der 90er Jahre wurde dieser Mechanismus als gentechnisches Werkzeug stetig weiterentwickelt und in den verschiedensten biologischen sowie medizinischen Bereichen eingesetzt. Dies ermöglichte nicht nur die Aufklärung unbekannter Gen-Funktionen durch Knockdown-Experimente, sondern auch die Entwicklung RNA-Interferenz-basierter Therapeutika. Hierbei stellt vor allem der Einsatz kurzer, nicht kodierender RNAs, welche die Genexpression mit Hilfe von RNAi beeinflussen können, eine vielversprechende Therapieoption dar. Sogenannte microRNAs (miRNAs) können einen wesentlichen Einfluss auf die Regulation unzähliger biologische Prozesse nehmen. Durch diese Beeinflussung, welche auch die Differenzierung und Proliferation von Zellen betreffen kann, können sie tumorsuppressive wie auch onkogene Eigenschaften besitzen. Neben den natürlich vorkommenden miRNAs wurde als Therapieansatz und zur gentechnischen Analyse ebenfalls synthetische kleine RNAs entwickelt, wie z.B. die small interfering RNAs (siRNAs). Dies ermöglichte es stabilere und modifizierte RNAs einzusetzen, was den Anwendungsbereich erweiterte sowie neue Therapiealternativen ermöglichte. Im ersten Projekt dieser Arbeit wurde untersucht, ob RISC-Komplexe an eine spezifische mRNA mit Hilfe eines bifunktionellen Adapter-Oligonukleotids umgeleitet werden können. Durch diesen Ansatz ist es möglich eine onkogene miRNA in ihrer Funktion zu inhibieren und gleichzeitig die Translation der mRNA eines Proto-Onkogens zu suppremieren und dadurch simultan einen synergistischen antitumorigenen Effekt zu erreichen. Dabei adressiert ein Teil des Adapters die onkogene miRNA, welche zuvor von einem RISC-Komplex gebunden wurde. Der zweite Adapter-Bereich ist gegen die 3'-UTR einer spezifischen mRNA adressiert und ermöglicht es so, den indirekt gebundenen RISC-Komplex zur mRNA umzuleiten und den Abbau dieser zu induzieren. Dieser Ansatz wurde zu Beginn der Untersuchungen bei dem Proto-Onkogen PIM1 und der onkogenen miR-20a, die die Proteinexpression des Zellzyklusregulators und Tumorsuppressors P21 herunterreguliert, analysiert. Es konnte mit Hilfe von in vitro Analysen gezeigt werden, dass mit miR-20a beladene RISC-Komplexe aus Zell-Lysaten eingefangen und isoliert werden können. In folgenden Zellkulturexperimenten wurde der Einfluss auf die Expression des Proto-Onkogens PIM1 und des Zellzyklusregulators P21 untersucht. Innerhalb der Zellkulturanalysen konnten Effekte auf die Expression der PIM1 Kinase festgestellt werden, was sich jedoch nicht eindeutig reproduzieren ließ. Auch nach einer Adressierungserweiterung der miR-20a zur kompletten miR-17 Familie sowie zur stärker exprimierten let-7 miRNA Familie, konnten keine stabilen Effekte in Zellkulturanalysen bei PIM1 sowie P21 festgestellt werden. Kürzlich konnte die Arbeitsgruppe von Michael Göbel jedoch in in vitro Experimenten bestätigen, dass beladene RISC-Komplexe mit Hilfe eines bifunktionalen Adapters zu einer spezifischen RNA umgeleitet werden können. Dies deutet darauf hin, dass es mit Hilfe eines stabileren mRNA Systems in Zukunft möglich ist, konstantere Ergebnisse in Zellkultur Experimenten zu erlangen. Ein Konjugat aus einem DNA/LNA Mixmer-Oligonukleotid und der synthetischen Nuklease Tris(2-aminobenzimidazol) wurde im zweiten Projekt dieser Arbeit untersucht. Aufbauend auf vielversprechende Ergebnisse mit entsprechenden DNA- sowie PNA-Konjugaten, welche in der Arbeitsgruppe von Michael Göbel erlangt werden konnten, wurden in dieser Arbeit zunächst in vitro Spaltkinetiken mit DNA/LNA Mixmer-Konjugaten durchgeführt. Diese bestätigten, dass der Wechsel zu DNA/LNA-Oligonukleotiden eine deutlich schnellere Spaltkinetik hervorbringt, wobei die Halbwertszeit der RNA-Substrate von 10 bis 20 Stunden auf 4 Stunden verkürzt werden konnte. Zudem spaltete das Nuklease-Konjugat RNA-Substrate von einer Länge von 412 Nukleotiden erfolgreich und spezifisch, was zuvor nur mit einer Substratlänge von 29 Nukleotiden gezeigt werden konnte. Die Spaltungsposition wurde ebenfalls charakterisiert und zeigt sich in unmittelbarer Nähe um die Bindung des Mixmer-Oligonukleotids mit dem adressierten RNA Substrat. Bei den durchgeführten Zellkulturanalysen wurde wie im ersten Projekt die mRNA der PIM1-Kinase adressiert, wobei vereinzelt Effekte beobachtet werden konnten, welche allerdings nicht reproduzierbar waren. Die vielversprechenden in vitro Ergebnisse indizieren jedoch, dass bei einer weiteren Verbesserung der Spaltkinetik, deutliche Effekte in Zellkulturanalysen erlangt werden können.
Physical Description:176 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2020.0477