Der Einfluss von MicroRNAs auf die Regulation des Ca2+-aktivierten K+-Kanals KCNN4 bei Nierenfibrose

Chronische Nierenkrankungen mit einer Funktionsverschlechterung bis zur terminalen Niereninsuffizienz stellen ein zunehmendes, weltweites Gesundheitsproblem dar. Die gemeinsame pathophysiologische Endstrecke der verschiedenen zugrundliegenden Nierenerkrankungen mündet in einen Fibrosierungsprozess m...

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Main Author: Mann, Christoph
Contributors: Hoyer, Joachim (Prof. Dr. med.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2019
Medizin
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Chronische Nierenkrankungen mit einer Funktionsverschlechterung bis zur terminalen Niereninsuffizienz stellen ein zunehmendes, weltweites Gesundheitsproblem dar. Die gemeinsame pathophysiologische Endstrecke der verschiedenen zugrundliegenden Nierenerkrankungen mündet in einen Fibrosierungsprozess mit Ersatz von funktionalem Parenchym durch Bindegewebe. Eine entscheidende Rolle des Umsatzes von extrazellulärer Matrix in diesem Prozess spielen aktivierte, proliferierende Fibroblasten. Zur Proliferation exprimieren Sie verstärkt einen calciumabhängigen Kaliumkanal (Synonym: KCNN4, IKca1). Es wird davon ausgegangen, dass dieser Kanal bei dem für die Proliferation notwendigen Calciumeinstrom durch seine Öffnung Membranleitfähigkeit für einen Kaliumausstrom herstellt und so verhindert, dass die Depolarisation der Membran dem weiteren Einstrom der 2-fach positiv geladenen Calciumionen entgegenwirkt. Die Expression dieser Kanäle ist in fibrotischen Nieren gesteigert. Ihre spezifische pharmakologische Blockade oder der genetische Knock-Out vermindern Proliferation von Fibroblasten in-Vitro und schützt Mäuse und Ratten vor einer durch unilaterale Ureterobstruktion induzierten Nierenfibrose in-Vivo. Über die zugrundliegenden Prozesse, die zur Heraufregulation des Kanals bei Fibrose führen, ist bisher wenig bekannt. Es wurde gezeigt, dass der Kanal der Regulation durch die RAS/RAF/Mek/Erk Kaskade unterliegt. Ziel dieser Arbeit war es, die Regulationsmechanismen des Kanals zu untersuchen und die Frage zu beantworten, ob microRNAs eine Rolle in der Expressionsregulation des KCNN4 spielen. Dazu wurde zunächst ein in-Vitro Fibrosemodell an kultivierten, murinen Nierengewebsfibroblasten etabliert. Nach Stimulation mit dem profibrotischen Zytokin FGF-2 wurde die Proliferation der Fibroblasten in einem MTT-basierten Proliferationsassay, die Kanalexpression auf mRNA Ebene mit quantitativer PCR sowie die Proteinfunktion des Kanals mittels Patch Clamp untersucht. Nachdem dieses in-Vitro Fibrosemodell seine Fähigkeit zur Steigerung der Proliferation, der Kanalexpression und der Kanalfunktion bewiesen hatte, wurde es herangezogen, um die Expression von miRNAs in einem miRNA-Microarray zu untersuchen. 107 Anschließend wurde das Ergebnis mittels miRNA-spezifischer, quantitativer realtime PCR validiert. Die Proliferation der Fibroblasten war in der FGF-2-Gruppe signifikant erhöht (p<0.001). Außerdem verdoppelte sich die Expression des Kanals in der quantitativen PCR (+91%) sowie der KCNN4-spezifische Strom in der Patch Clamp Messung (+125%) nach FGF-2 Stimulation. Das MicroRNA-Microarray, in dem die Expression aller zu diesem Zeitpunkt bekannten MicroRNAs einer FGF-2stimulierten Gruppe mit einer Kontrollgruppe vergleichen wurde, zeigte mehrere miRNAs mit einer signifikanten Änderung ihrer Expression unter FGF-2 Stimulation. Hierunter zeigte miR-503 (ein Mitglied der miR-424 Familie) die stärkste Änderung ihrer Expression: Eine Verminderung der Expression um den Faktor 4. Diese Expressionsverminderung konnte in einer miR-503-spezifischen, quantitativen real-time PCR bestätigt werden. Daraufhin wurde ein Referenzgenom auf Bindungsstellen für diese miRNA untersucht. Es zeigte sich, dass KCNN4 selbst keine Bindungsstelle für miR-503 aufweist. Allerdings weist ein bekannter Upstreamregulator des Kanals, RAF1, eine Bindungsstelle der miR-503 in seiner 3’untranslatierten Region auf. Es erfolgte eine in-silico Bindungsstellenanalyse, die eine hohe Wahrscheinlichkeit einer biologisch relevanten Bindung der miR-503 an RAF1 erbrachte. Dies führt zu einer Regulationshypothese, in der nach profibrotischer Stimulation am FGF-Rezeptor die erhöhte Aktivität der RAS/RAF/Mek/Erk Kaskade sowie die Enthemmung von RAF1 durch erniedrigte miR-503 Aktivität in der Förderung der KCNN4-Expression kooperieren. Die in-silico Analyse weiterer Ziele der miR-503 zeigt zahlreiche Gene, die in Prozesse der Proliferation und der Zellzyklusregulation involviert sind. Dies deutet daraufhin, dass miR-503 (und die miR-424 Familie) in ein komplexes Netzwerk zur Regulation von Proliferation eingebunden sind. Diese Ergebnisse machen miR-503 zu einem interessanten Ziel zukünftiger Forschung in der Pathophysiologie von Erkrankungen, die auf vermehrter Zellproliferation basieren, wie beispielsweise Fibrose oder Krebserkrankungen.
Physical Description:122 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2020.0006