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Molekulare Autopsie der nah verwandten ABC-Transporter OpuB und OpuC aus Bacillus subtilis
In seinem natürlichen Habitat ist das Bodenbakterium B. subtilis zahlreichen Stressfaktoren ausgesetzt. Eine aktive Adaption an Stresssituationen, welche es der Zelle ermöglicht gezielt auf Veränderungen in der Umwelt zu reagieren, ist essentiell für das Überleben in einem solchen Lebensraum. Um sic...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2018
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| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | In seinem natürlichen Habitat ist das Bodenbakterium B. subtilis zahlreichen Stressfaktoren ausgesetzt. Eine aktive Adaption an Stresssituationen, welche es der Zelle ermöglicht gezielt auf Veränderungen in der Umwelt zu reagieren, ist essentiell für das Überleben in einem solchen Lebensraum. Um sich vor einer zu hohen Osmolarität zu schützen, akkumuliert B. subtilis organische Osmolyte, sogenannte kompatible Solute. Glycin Betain ist eines der weit verbreitetsten und wichtigsten kompatible Solute. Dieses Substrat kann auch über die Enzyme GbsA und GbsB aus dem Vorläufer Cholin synthetisiert werden. Der Cholin-sensitive Repressor GbsR reguliert hierbei sowohl die Expression des gbsAB Operons als auch des opuB Operons. Der ABC Transporter OpuB gehört zu den fünf Osmolyt Aufnahmesystemen von B. subtilis. Dieser Importer ist hoch spezifisch und transportiert mit hoher Affinität nur Cholin. Der nah verwandte ABC Transporter OpuC, welcher strukturell sehr ähnlich zu OpuB ist, ist in der Lage eine große Vielzahl an unterschiedlichen kompatiblen Soluten in die Zelle zu transportieren.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Substratbindeproteine von OpuB und OpuC modular genutzt werden können. Hybride ABC Transporter, in denen die SBPs OpuBC und OpuCC ausgetauscht wurden, sind funktionell im Transport osmoprotektiver Substanzen. Die Substrat-spezifitäten der ursprünglichen Wildtyp ABC Transporter OpuB und OpuC wurden durch das Implantieren des jeweilig anderen SBPs ausgetauscht. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass B. subtilis in-vivo ein einzelnes OpuCC SBP ohne weitere Komponenten, als Bindeprotein für den vollständigen OpuB Transporter nutzen kann. Die unterschiedliche Substratspezifität von OpuB und OpuC kommt durch strukturellen Begebenheiten in der Ligandenbindetasche der SBPs zu Stande. Ein Threonin im promiskuitiven OpuCC SBP und ein negativ geladenes Aspartat im OpuBC SBP determiniert das Substratspektrum des ganzen ABC Transporters. Bioinformatische Analysen zeigten, dass OpuCC-Typ SBPs immer ein Threonin und OpuBC-Typ SBPs immer ein Aspartat besitzen. Mit Hilfe dieser Ergebnisse und phylogenetischen Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass das spezifische OpuB System, als Anpassung an die Gegebenheiten im Boden, durch Genduplikation aus dem OpuC Transporter entstanden ist.
Im Zuge dieser bioinformatischen Analyse wurde ein neuer wichtiger ABC Transportertyp der Ordnung Bacillales gefunden. Dieser OpuF Importer besitzt ein hybrides SBP-TMD Protein. Drei fusionierte OpuF ABC Transporter aus der Gattung Bacillus konnten heterolog in B. subtilis charakterisiert werden. Physiologische sowie kinetische Untersuchungen bewiesen, dass es sich bei zwei der untersuchten Transporter um hoch affine Glycin Betain Aufnahmesysteme handelt.
Mit Hilfe eines genetischen Suppressor Screens konnte die Struktur/Funktions-Beziehung des Repressors der Glycin Betain Synthese GbsR näher untersucht werden. Durch eine Charak-terisierung von verschiedenen Suppressor Mutanten konnte die Bedeutsamkeit einer flexiblen Linkerdomäne des Proteins herausgestellt werden. Nicht nur die Domäne, welche im direkten Kontakt mit der DNA steht, spielt eine essentielle Rolle bei der Repression von opuB und gbsA. Durch den flexiblen Linker des Proteins wird eine dynamische Konformationsänderung von GbsR ermöglicht und die DNA-Bindung ist von dieser Dynamik abhängig.
Schließlich wurde ein neues kompatibles Solut für B. subtilis gefunden. Das Cholin-Derivat Homocholin kann sowohl über den spezifischen OpuB und als auch über den OpuC importiert werden und wird dann über die promiskuitiven Dehydrogenasen GbsA und GbsB zu dem Osmolyt Homobetain oxidiert. Dieser Syntheseweg wird von GbsR reguliert, allerdings ist eine Bindung von Homocholin an GbsR natürlicherweise nicht möglich. Ein genetischer Screen identifizierte einen einzelnen Aminosäureaustausch, durch welchen es möglich war, eine gbsAB Induktion durch Homocholin durch die Bindung von GbsR zu erlangen. Demnach konnte der Mechanismus der osmoprotektiven Eigenschaft des Cholin-Derivats Homocholin molekular aufgeklärt werden. |
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| Umfang: | 170 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2018.0507 |