Untersuchungen von Methyltransferasen aus Linum-Arten

Lignane sind in der Pflanzenwelt weit verbreitet und dienen in der Pflanze vor allem zur Abwehr von Schädlingen. Interessant sind Lignane durch ihre ausgeprägte biologische Aktivität. Ein Beispiel für einen medizinisch eingesetzten Stoff ist das Aryltetralinlignan Podophyllotoxin (PTOX), das cytotox...

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Main Author: Robinson, Jennifer
Contributors: Petersen, Maike (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2018
Pharmazeutische Biologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Lignane sind in der Pflanzenwelt weit verbreitet und dienen in der Pflanze vor allem zur Abwehr von Schädlingen. Interessant sind Lignane durch ihre ausgeprägte biologische Aktivität. Ein Beispiel für einen medizinisch eingesetzten Stoff ist das Aryltetralinlignan Podophyllotoxin (PTOX), das cytotoxische Aktivität besitzt. Es wird zur Behandlung von Feigwarzen eingesetzt, wird aber auch in der Produktion der PTOX-Derivate Etoposid und Teniposid genutzt. Diese Arzneistoffe werden zur Therapie verschiedener Krebs-Arten angewendet. Die Gewinnung des Podophyllotoxins erfolgt aus den Arten Podophyllum hexandrum und Podophyllum peltatum (Berberidaceae). Die Biosynthese von Aryltetralinlignanen wird in die frühen und späten Schritte eingeteilt. Während die frühen Reaktionsschritte mittlerweile komplett identifiziert werden konnten, sind bezüglich der späten Schritte einige Enzyme und Reaktionen unbekannt. Eine Enzymklasse, die hier von Interesse ist, sind Methyltransferasen. Bei diesen Enzymen wird eine Methylgruppe, die von einem Methylgruppendonor zur Verfügung gestellt wird, auf ein Substrat übertragen. Die Experimente in dieser Arbeit wurden mit Suspensionskulturen von Linum nodiflorum, Linum album und Linum flavum aus der Familie Linaceae durchgeführt, da sie Aryltetralinlignane akkumulieren können. Zu Beginn wurden Samen aus Linum nodiflorum zum Keimen gebracht und damit Kallus- und Suspensionskulturen in verschiedenen Medien angelegt. Von den anderen Linum-Arten waren schon die Suspensionskulturen vorhanden. In den Kulturen in CB2- und B5-Medium wurden weniger Lignane gebildet als in MSLi-Medium. Von den zwei Kulturen in MSLi-Medium akkumulierte Ln1 hauptsächlich Desoxypodophyllotoxin (DOP), aber auch 6-Methoxypodophyllotoxin (MPTOX) und Ln2 lieferte PTOX als Hauptlignan neben MPTOX und DOP. Zusätzlich wurden mit dem Elicitor Methyljasmonat (MeJa) Versuche mit beiden Suspensionskulturen Ln1 und Ln2 durchgeführt, um die Produktion der Lignane zu erhöhen. Die Ergebnisse zeigten aber nicht die gewünschte Wirkung auf den Gehalt der Lignane. Die Suspensionskultur Ln1 wurde über einen Zeitraum von 14 Tagen in Form einer Kulturcharakterisierung untersucht. Dabei wurden Daten zu Medium (Zuckergehalt, pH-Wert, Leitfähigkeit), Zellparameter (Frisch- und Trockengewicht), Lignan- und Proteingehalt, Phenylalanin Ammoniak-Lyase-Aktivität, sowie die Genexpression verschiedener Methyltransferasen gesammelt. Neben den Untersuchungen zu den Suspensionskulturen wurden mehrere Methyltransferasen molekularbiologisch identifiziert und biochemisch charakterisiert. Die Coniferylalkohol 9-O-Methyltransferase katalysiert die Methylierung von Coniferylalkohol an der aliphatischen Hydroxy-Gruppe. Wolters et al. (2013) hat von diesem Enzym Mutanten hergestellt, um den Reaktionsmechanismus zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden Km-Wert und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit der Mutanten C271A und C271S ermittelt. Der Km-Wert lag für C271A bei etwa 8,91 µM und für C271S bei 2,58 µM. Ein weiteres zu charakterisierendes Enzym war die Kaffeesäure O-Methyltransferase aus Linum nodiflorum (LnCOMT). Es konnte gezeigt werden, dass diese Methyltransferase Kaffeesäure zu Ferulasäure umsetzt. Die Aktivität war aber für eine Bestimmung der kinetischen Parameter zu gering. Im Zuge der Identifizierung von Enzymen, die an der Lignanbiosynthese beteiligt sind, wurde der Fokus auf Methyltransferasen gelegt. Aus den bekannten konservierten Bereichen dieser Enzyme wurden degenerierte Primer erstellt, die über eine PCR Teilsequenzen von Methyltransferasen aus Linum album und Linum nodiflorum lieferte. Die Methyltransferase aus Linum album (LaCOMT) zeigte eine hohe Aktivität mit Kaffeesäure und eine geringere mit Isoferulasäure. Mit Kaffeesäure hatte das Enzym ein Temperaturoptimum von 40°C und ein pH-Optimum von 6. Der ermittelte Km-Wert für Kaffeesäure lag bei etwa 90,75 µM und für SAM bei 17,35 µM. Der Vergleich zwischen LaCOMT und LnCOMT ergab zwar eine Identität von 95,5% (Nukleotidsequenz), trotzdem wurde ein deutlicher Unterschied in der Aktivität beobachtet. Nach erfolgreicher Sequenzierung der Volllänge der Methyltransferase LnMT3 aus Linum nodiflorum zeigte sich, dass zwei Methionincodons als Startcodon in Frage kamen. Deshalb wurden zwei Methyltransferasen (LnMT3 und LnMT3s) isoliert, kloniert und exprimiert. Beide Enzyme wurden auf ihre Aktivität getestet und setzten die gleichen Substrate um, weshalb eine Auswahl des richtigen Startcodons nicht möglich war. Die umgesetzten Substrate waren die Flavonoide Hesperetin, Quercetin, Chrysin und in einem geringeren Maß auch Luteolin-7-Glucosid. Bei Hesperetin konnte die Methylierung der 3‘-Hydroxygruppe nachgewiesen werden. Nicht alle Substrate aus der Lignanbiosynthese waren verfügbar, deshalb müssen in Zukunft weitere Tests zeigen, ob LnMT3/LnMT3s nicht doch an der Lignanbiosynthese beteiligt sind.
Physical Description:155 pages.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2018.0231