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Charakterisierung immuninhibitorischer Eigenschaften von SIGIRR und die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humanes SIGIRR
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden immuninhibitorische Eigenschaften SIGIRRs in der Stimulation primärer muriner Zellen untersucht. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humanes SIGIRR. Fragestellung der Arbeit war es, eine Betei...
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| 第一著者: | |
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| その他の著者: | |
| フォーマット: | Dissertation |
| 言語: | ドイツ語 |
| 出版事項: |
Philipps-Universität Marburg
2016
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| 主題: | |
| オンライン･アクセス: | PDFフルテキスト |
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| 要約: | Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden immuninhibitorische Eigenschaften SIGIRRs in der Stimulation primärer muriner Zellen untersucht. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humanes SIGIRR. Fragestellung der Arbeit war es, eine Beteiligung SIGIRRs an der Immunregulation muriner Milzzellen, B-Zellen und myeloiden dendritischen Zellen in Bezug auf unterschiedliche Tolllike Rezeptoren aufzuzeigen und zu charakterisieren, wann und ggf. durch welche Mechanismen eine solche zustande kommt. Hergestellte und auf ihre Eigenschaften hin untersuchte monoklonale Antikörper gegen humanes SIGIRR sollten genutzt werden um die Expression SIGIRRs mithilfe Immunfluoreszenz zu untersuchen. Dazu wurden zum Einen aus der Maus isolierte Zellen von Wildtypmäusen im Vergleich zu SIGIRR-Knockoutmäusen stimuliert und in ihrem Reaktionsmuster verglichen. Zum Anderen wurden, nach Immunisierung von SIGIRR-Knockoutmäusen mit SIGIRR, Hybridoma-Zellen generiert. Diese wurden auf die Produktion brauchbarer Antikörper getestet und die resultierenden Antikörper auf ihre Anwendbarkeit in ELISA, Westernblot und FACS untersucht. In den Stimulationsexperimenten zeigt sich entgegen der Hypothese keine Unterschiede zwischen WT-Mäusen und SIGIRRKnockoutmäusen bei der Stimulation mit unterschiedlichen LPS Liganden für Milzzellen, B-Zellen und myeloide dendritische Zellen. Eine Einfluss SIGIRRs auf die Immunregulation dieser Zellen konnte damit, entgegen der Aussage einschlägiger Literatur, unter den hier angewandten Bedingungen nicht nachgewiesen werden. Lediglich Vorexperimente mit MACS separierten CD11c+ konnten Hinweise auf einen solchen Sachverhalt liefern. Die Antikörperherstellung lieferte spezifische Antikörper gegen humanes SIGIRR mit guten Bindungseigenschaften in ELISA und Westernblot. Im FACS konnte in der Oberflächenfärbung SIGIRR an der Oberfläche von mit SIGIRR und Signalpeptid transfizierten HEK-Zellen nachgewiesen werden. Damit ist in den Stimulationsexperimenten insbesondere die Abweichung von der gestellten Hypothese und den meisten bisherigen Publikationen bemerkenswert, wodurch die Diskussion möglicher Ursachen, wie sie in der vorliegenden Arbeit unternommen wird, entscheidend für mögliche zukünftige Ansätze ist. Problematisch in der Antikörperherstellung zeigte sich die in fortlaufender Kultur beständig nachlassende Antikörperproduktion, bzw. eine verminderte Spezifität der produzierten Antikörper. Es konnten mit den bereits gewonnenen Antikörpern jedoch einige Aufschlüsse zu SIGIRR erzielt werden. In zukünftigen Experimenten bietet sich die Verwendung von MACS separierten CD11c positiver dendritischer Zellen in Stimulationsexperimenten mit SIGIRR-Knockoutmäusen an.
Die laborinterne Herstellung SIGIRR-spezifischer Antikörper ist eine zeitintensive aber erfolgversprechende Methode, wenn ausreichend früh Subklonierungen durchgeführt werden, muss aber gegen die Möglichkeit eines käuflichen Erwerbs abgewogen werden. Mit SIGIRR-spezifischen Antikörpern könnte insbesondere, z.B. mit fluroeszenzmarkierten Antikörpern, das Expressionsmuster von SIGIRR in Zellen untersucht werden. |
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| 物理的記述: | 197 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2016.0883 |