Funktionelle Charakterisierung der Glykoproteine eines neu entdeckten afrikanischen Henipavirus

Henipaviren sind hochpathogene Paramyxoviren, von denen zurzeit nur zwei Vertreter bekanntermaßen Infektionen im Menschen oder Nutztieren verursachen können. Das Hendra-Virus kommt in Australien vor und verursacht vor allem respiratorische Infektionen in Pferden. Das Nipahvirus (NiV) stammt aus Südo...

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Main Author: Weis, Michael
Contributors: Maisner, A. (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2015
Medizin
Subjects:
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Description
Summary:Henipaviren sind hochpathogene Paramyxoviren, von denen zurzeit nur zwei Vertreter bekanntermaßen Infektionen im Menschen oder Nutztieren verursachen können. Das Hendra-Virus kommt in Australien vor und verursacht vor allem respiratorische Infektionen in Pferden. Das Nipahvirus (NiV) stammt aus Südostasien, wo es regelmäßig kleinere Ausbrüche schwerer Enzephalitiden im Menschen verursacht. Generell sind Henipavirus-Infektionen zoonotische Infektionen, wobei fruchtfressende Flughunde der Gattung Pteropus das natürliche Reservoir darstellen. Bis vor wenigen Jahren ging man davon aus, dass die Verbreitung der Viren auf Südostasien und Australien beschränkt ist. Im Jahr 2009 gelang es jedoch in Afrika aus Flughunden der Gattung Eidolon helvum neue Henipavirus-ähnliche RNA-Sequenzen isolieren. Eines dieser neu entdeckten afrikanischen Henipaviren, GH-M74a (M74), konnte vollständig sequenziert und kloniert werden. Da es bis heute nicht möglich war, vermehrungsfähige Viren aus Flughunden zu isolieren, basiert die Einschätzung ihres zoonotischen Potentials zurzeit auf Funktionsanalysen einzelner viraler Proteine im Vergleich zu den homologen Proteinen humanpathogener Henipaviren. Aufgrund ihrer wichtigen funktionellen Bedeutung für eine erfolgreiche Infektion neuer Wirtszellen und die Virusausbreitung von Zelle zu Zelle sollten in dieser Arbeit die beiden Oberflächen-Glykoproteine, das Rezeptor-bindende G und das Fusions-vermittelnde F-Protein, des neu entdeckten M74-Isolats funktionell charakterisiert werden. Hierfür wurden die M74-Glykoproteine zunächst in den Expressionsvektor pCAGGS kloniert. Um ihre Detektion zu ermöglichen wurden sie mit einem HA- bzw. FLAG-tag versehen. Mit Hilfe indirekter Immunfluoreszenz-Analysen wurde dann erst einmal nachgewiesen, dass alle klonierten Konstrukte exprimiert werden. Die Fähigkeit der beiden M74-Glykoproteine bei Koexpression Zell-Zell-Fusion zu vermitteln war allerdings gering und auf sehr wenige Zelllinien beschränkt. Ein Fusionsassay mit den heterotypischen NiV-G bzw. F-Proteinen ergab, dass der Hauptgrund für die geringe Fusionsaktivität im M74-F-Protein liegt. Anschließende Western Blot Analysen zeigten zwar eine mit dem NiV-F vergleichbar gute Gesamtexpression, M74-F wurde jedoch deutlich ineffektiver proteolytisch aktiviert und war kaum in fusionsaktiver Form auf der Zelloberfläche nachweisbar. Koimmunfluoreszenzen mit dem NiV-F zeigten außerdem deutliche Unterschiede in der intrazellulären Verteilung der beiden Proteine. Darüber hinaus wiesen Inhibitionsstudien zwar auf eine Endozytose-abhängige Spaltung des M74-F hin, zeigten aber, dass das M74-F nicht durch die NiV-F aktivierenden endosomalen Proteasen Cathepsin B und L gespalten wird. Dies spricht eindeutig für unterschiedliche intrazelluläre Transportwege. Um zu klären, ob dieser veränderte Transport und die geringe Oberflächenexpression auf bestimmte Protein-Bereiche zurückzuführen sind, wurden im zweiten Teil der Arbeit verschiedene M74-F Chimären sowie Deletions- und Punktmutanten untersucht. Die Tatsache, dass mit keiner der eingebrachten größeren und kleineren Mutationen, die Funktionalität verbessert werden konnte, lässt vermuten, dass die im Vergleich zu anderen humanpathogenen Henipaviren geringere Oberflächenexpression und Fusionsaktivität des M74-F-Proteins, eine konservierte intrinsische Eigenschaft ist. Eine solch reduzierte Bioaktivität eines Fusionsproteins könnte durchaus einen Vorteil für ein Flughund-Henipavirus darstellen. So könnte eine zu starke Ausbreitung im Reservoir-Wirt vermieden werden, was eine langfristige Infektion und somit das „Überleben“ der Viren ermöglichen könnte. Eine solch reduzierte Aktivität würde darüber hinaus auch das zoonotische Potential eines afrikanischen Henipavirus stark einschränken.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2015.0264