Aldehyd-oxidierende Enzyme im anaeroben Phenylalanin-Stoffwechsel von Aromatoleum aromaticum

Der anaerobe Abbau von Phenylalanin führt über das Zwischenprodukt Phenylacetat zu Benzoyl-CoA, dem häufigsten Intermediat im anaeroben Abbau von aromatischen Verbindungen. Das Zwischenprodukt Phenylacetat entsteht durch die Oxidation von Phenylacetaldehyd. Vor Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass...

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Main Author: Debnar-Daumler, Lisa Lena Carlotta
Contributors: Heider, Johann (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2014
Biologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Der anaerobe Abbau von Phenylalanin führt über das Zwischenprodukt Phenylacetat zu Benzoyl-CoA, dem häufigsten Intermediat im anaeroben Abbau von aromatischen Verbindungen. Das Zwischenprodukt Phenylacetat entsteht durch die Oxidation von Phenylacetaldehyd. Vor Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass Aromatoleum aromaticum sowohl eine Aldehyd:Ferredoxin-Oxidoreduktase (AOR) besitzt, die den Schritt katalysieren könnte, als auch ein oder mehrere Enzyme, die diese Oxidation mit NAD und NADP als Elektronenakzeptoren durchführen könnten. Folglich stellte sich die Frage, welches dieser Enzyme das Schlüsselenzym für den anaeroben Phenylalanin-Stoffwechsel darstellt. Außerdem ist die Entdeckung einer AOR in einem fakultativ anaeroben Bakterium ungewöhnlich, da AORs bisher ausschließlich aus obligat anaeroben, häufig hyperthermophilen Prokaryonten bekannt sind. A. aromaticum braucht ein Molybdän-Enzym zum denitrifizierenden Wachstum, nämlich die Nitrat-Reduktase. Alle bisher beschriebenen AORs enthalten das dem Molybdän sehr ähnliche Metall Wolfram. Vor diesem Hintergrund sollte untersucht werden, welches Metall die AOR aus A. aromaticum enthält. Für beide Fragestellungen war es wichtig, die Phenylacetaldehyd-oxidierenden Enzyme aus A. aromaticum-Zellen anzureichern und im Idealfall aufzureinigen. Durch vielfältige chromatographische Verfahren gelang es, alle Enzymaktivitäten in einem für die Bearbeitung der Fragestellungen ausreichenden Maße anzureichern. Metallanalysen der angereicherten AOR-Fraktionen und begleitende Wachstumsversuche mit verschiedenen Molybdat- und Wolframat-Konzentrationen zeigten, dass die AOR tatsächlich einen Wolfram-Cofaktor enthält und dieser nicht wirksam durch einen Molybdän-Cofaktor ersetzt werden kann. Folglich muss A. aromaticum zur selben Zeit spezifisch mindestens ein Mo- (Nitrat-Reduktase) und ein W-Enzym (AOR) herstellen können. Während die meisten Enzyme aus dem Molybdän-Cofaktor-Biosyntheseweg auch zur Biosynthese des Wolfram-Cofaktors dienen können, wurden in dieser Arbeit durch bioinformatische Analysen mehrere Enzyme gefunden, die eine Metall-Spezifität unterstützen könnten. Dazu gehören Molybdat- und Wolframat-spezifische Transporter und Enzyme, die das Metall auf den Cofaktor übertragen. Außerdem wurden Proteine aus dem Cofaktor-Biosyntheseweg gefunden, die in enger Assoziation mit AORs codiert werden und möglicherweise auch bei der Bereitstellung des richtigen Cofaktors eine Rolle spielen. Durch Anreicherung der NAD(P)-abhängigen Phenylacetaldehyd-oxidierenden Aktivitäten konnte das zugehörige Enzym, eine Aldehyd-Dehydrogenase, die durch das Gen ebA4954 codiert wird, identifiziert werden. Die Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase (PDH) wurde heterolog produziert, mithilfe eines C-terminalen Strep-Tags aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Es handelt sich um ein Homotetramer, das sehr spezifisch für Phenylacetaldehyd ist, eine kooperative Kinetik zu diesem Substrat zeigt, stark durch steigende Phenylacetaldehyd-Konzentrationen inhibiert wird und sowohl NAD als auch NADP reduzieren kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit führen zu der neuen Hypothese, dass die PDH das Schlüsselenzym für den Phenylalanin-Stoffwechsel ist. Es wurde gezeigt, dass die AOR nicht essentiell für das denitrifizierende Wachstum auf Phenylalanin ist, aber verschiedenste Aldehyde mit ähnlichen Reaktionsgeschwindigkeiten oxidieren kann. Deshalb ist es vorstellbar, dass der AOR eine Funktion zur Detoxifizierung reaktiver Aldehyde zukommt, wenn der Stoffwechsel aus dem Gleichgewicht gerät. Die Erkenntnis, dass A. aromaticum gleichzeitig Molybdän- und Wolfram-Enzyme produzieren kann, eröffnet viele neue Fragestellungen und Forschungsansätze.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2014.0411