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Strahlenbiologische Charakterisierung des murinen Lewis-Lung-Modells
Hauptbestandteil der Arbeit war die strahlenbiologische Charakterisierung muriner LLC1-Zellen in vitro. Dabei handelt es sich um in Kultur überführte Einzelzellen eines bei in vivo Experimenten weit verbreiteten Tumormodells der Maus. Die soliden, entdifferenzierten Tumorzellverbände in vivo ents...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2013
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Hauptbestandteil der Arbeit war die strahlenbiologische Charakterisierung
muriner LLC1-Zellen in vitro. Dabei handelt es sich um in Kultur überführte
Einzelzellen eines bei in vivo Experimenten weit verbreiteten Tumormodells
der Maus. Die soliden, entdifferenzierten Tumorzellverbände in vivo entsprachen
einem nichtkleinzelligen Bronchialkarzinom, auch die in Kultur überführten
Einzelzellen konnten aufgrund von Kernpleomorphie, Hyperchromasie,
atypischen Mitosen und verschobener Kern-Plasma-Relation als maligne
eingestuft werden. In Kultur zeigten die LLC1-Zellen unter optimalen Bedingungen
ein schnelles, stabiles Wachstumsverhalten- mit einer Verdopplungszeit
von 16 h- auch über lange Kultivierungszeiträume hinweg, reagierten
aber Wachstumsmedium, Aussaatdichte sowie Art und Beschichtung der
Wachstumsfläche betreffend, ausgesprochen sensibel auf Veränderungen des
Kultur-Milieus. Dabei prägten sie divergente Phänotypen aus, die sich vor
allem hinsichtlich ihrer Morphologie, Adhäsionsfähigkeit und Plattierungseffizienz
voneinander unterschieden. Genotypisch wies der Großteil der Zellen
tetraploide Chromosomensätze mit 80 Einzelchromosomen auf. Die exakte
Orientierung an den ermittelten optimalen Kulturbedingungen war, durch
Reduktion von Störfaktoren einer kultivierungsbedingten zellulären Beeinträchtigung,
Grundlage der Aussagekraft und Reproduzierbarkeit weiterführender
strahlenbiologischer Analyseverfahren.
Anhand mathematisch (Single-Hit-Multi-Target-Modell & Linearquadratisches
Modell) ermittelter Kenngrößen aus generierten DEKs ließen sich die
LLC1-Zellen als strahlensensible Zellen mit mäßig bis schlecht ausgeprägter
Reparaturkapazität einstufen, die strahlenbiologisch eher einem frühreagierenden
Zellsystem entsprechen. Trotz einer generell eher schwach ausgeprägten
Reparaturkapazität waren die Mechanismen der schnellen DNA-DSB
Reparatur intakt und entsprachen sowohl zeitkinetisch als auch dimensional
denen anderer bereits in der Literatur beschriebener maligner Zellen.
In der Genexpressionsanalyse zeigte sich für LLC1-Zellen keine suffiziente
Genregulation p53 abhängiger Gene nach Photonenbestrahlung. Die reparaturrelevanten Gene RRM2b und ERCC1, das apoptoserelevante BAX und das
zellzyklusregulierende CDKN1A waren durch Photonenbestrahlung nicht
induzierbar.
Gene mit p53 unabhängigen Regulationsmechanismen wie das zellzyklusregulierende
Gen GADD45 und die apoptoserelevanten Gene BCL2 und BIRC5
waren induzierbar und führten in LLC1-Zellen zu G2-Arretierung und Apoptoseinduktion
nach Photonenbestrahlung. Dabei erfolgte die Verschiebung
des zellulären Gleichgewichts hin zu proapototischen Mechanismen nach
Photonenbestrahlung nicht durch Überexpression des, in LLC1-Zellen nicht
strahleninduzierbaren, proapoptotischen Gens BAX, sondern primär durch
Unterexpression antiapoptotischer Gene wie BCL2/BIRC5 mit konsequenterweise
fehlender Hemmung der Apoptoseinduktion.
Nach Exposition gegenüber hohen Dosen (6 Gy) leiten LLC1-Zellen einen
GADD45 vermittelten, lang andauernden, potentiell zeitlich unbegrenzten
G2-Arrest ein. Hingegen war nach Bestrahlung mit geringeren Dosen von 2
Gy ein Ende des G2-Arrests zwischen 18 h und 24 h post rad festzustellen.
Eine G1-Arretierung erfolgt in LLC1-Zellen auch nach Exposition gegenüber 6
Gy Photonen nicht.
Im quantitativen screening mittels Westernblot zeigte sich in LLC-Zellen eine
p21 Defizienz als Ursache der fehlenden G1-Arretierung, eine Phosphorylierung
von p53 an Serin 15 war hingegen nachweisbar und zeigte einen strahleninduzierten
Anstieg auf Proteinebene.
Die daraufhin durchgeführte p53 Mutationsanalyse mittels Gensequenzierung
zeigte in Sequenz 1 (94-115 forward) an Basenposition 120 eine heterozygote
Mutation zum STOP-Codon UAA. Durch diese Mutation ist eine suffiziente
Proteinbiosynthese des p53-Proteins in LLC1-Zellen nicht möglich
und eine Funktionalität des Proteins nicht gegeben.
Diese fehlerhafte Proteinstruktur des p53 erklärt sowohl den fehlenden G1-
Arrest, die p21-Defizienz als auch die fehlende Induzierbarkeit p53-
abhängiger Gene wie CDKN1A, RRM2b, ERCC1 und BAX auf mRNA-Ebene, bei
gleichzeitig gelelektrophoretisch nachweisbarem p53. |
|---|---|
| DOI: | 10.17192/z2013.0138 |