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Identifizierung und Charakterisierung von Siderophorbindungsproteinen aus Bacillus subtilis
Um die Versorgung mit dem essentiellen Spurenelement Eisen sicherzustellen, haben Mikroorganismen eine Vielzahl von Strategien entwickelt. Die Sekretion von niedermolekularen, chelatisierenden Molekülen, den sogenannten Siderophoren, nimmt unter den bakteriellen Eisenakquirierungsstrategien eine bes...
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| 第一著者: | |
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| フォーマット: | Dissertation |
| 言語: | ドイツ語 |
| 出版事項: |
Philipps-Universität Marburg
2011
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| 主題: | |
| オンライン･アクセス: | PDFフルテキスト |
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| 要約: | Um die Versorgung mit dem essentiellen Spurenelement Eisen sicherzustellen, haben Mikroorganismen eine Vielzahl von Strategien entwickelt. Die Sekretion von niedermolekularen, chelatisierenden Molekülen, den sogenannten Siderophoren, nimmt unter den bakteriellen Eisenakquirierungsstrategien eine besonders prominente Rolle ein. Die Wiederaufnahme der eisenbeladenen Siderophore durch Mikroorganismen stellt dabei einen Schlüsselprozess dar und ist daher ein attraktives Ziel für potentielle Antibiotika. Hochaffine Bindung der Siderophore erfolgt durch Substratbindungsproteine, die Teil von ATP-Bindungskassetten-Transportern sind. Die potentielle Ausnutzung der Transportwege durch Wirkstoffe verlangt eine umfassende funktionelle und strukturelle Charakterisierung der beteiligten Proteine.
In dieser Arbeit wurde ein Affinitätschromatographie-basiertes Verfahren zur Isolierung und Identifizierung eines Substratbindungsproteins aus Zelllysaten durch direkte Wechselwirkung mit seinem natürlichen Liganden entwickelt. Synthetische Derivate des Siderophors Petrobactin wurden auf einer Agarose‒Streptavidin-Matrix immobilisiert und mit dem Zelllysat einer Bacillus subtilis-Kultur behandelt, was die erfolgreiche Identifizierung des Petrobactin-
Bindungsproteins FpiA ermöglichte. Die anschließende biochemische und physiologische Charakterisierung des Proteins bestätigte seine Signifikanz für die Petrobactin-Aufnahme und belegt damit das Potential dieser neuen Methode.
Weiterhin wurde das Triscatecholat-Bindungsprotein FeuA aus B. subtilis strukturell und funktionell charakterisiert. Cokristallstrukturen mit den Siderophoren Bacillibactin und Enterobactin sowie dem Siderophor-Mimetikum mecam zeigten einen nahezu identischen Bindungsmodus für die drei verwandten, aber dennoch verschiedenen Eisenkomplexanionen. Eine basische Triade in der Bindungstasche wurde als Hauptbindungsmotiv für die Substrate identifiziert und durch ortsgerichtete Mutagenese und nachfolgende Charakterisierung der Varianten durch Fluoreszenzspektroskopie und ligandenabhängige Schmelzpunktanalyse untersucht. Kristallographische und CD-spektroskopische Experimente zeigten, dass die Bindungstasche nur Lambda-stereokonfigurierte Siderophore zulässt, daher wird beispielsweise die Delta-Stereokonfiguration des
Eisenkomplexes von Enterobactin bei Bindung durch FeuA invertiert. Auffällig war der nahezu identische Bindungsmodus des Proteins für die verschiedenen Substrate, welcher mit einer Kippbewegung der zwei Domänen von FeuA um etwa 20° einhergeht, der größten bisher experimentell beobachteten Domänenbewegung eines Substratbindungsproteins der Klasse III. Diese Ähnlichkeit des Bindungsmodus impliziert seine Bedeutung für die nachfolgende Erkennung von FeuA durch die kognaten Transmembrandomänen FeuBC des Transporters, die durch Positionierung
konservierter Glutamatreste auf der Oberfläche von FeuA ermöglicht wird.
Diese Arbeit zeigt einen neuartigen Ansatz zur Identifizierung bakterieller Substratbindungsproteine und bietet einen detaillierten strukturellen und funktionellen Einblick in die Bindung von Triscatecholatsiderophoren durch solche Proteine. |
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| DOI: | 10.17192/z2011.0606 |