Molekulare Mechanismen der STAT1-vermittelten Erkennung und Aktivierung von Zielgenen

Von allen Mitgliedern der STAT-Familie ist die Signaltransduktion durch den Trans-kriptionsfaktor STAT1 bislang am besten untersucht, trotzdem sind noch viele Fragen bezüglich des Mechanismus einer effektiven Zielgenaktivierung offen. Insbesondere die molekularen Schritte der Zielgenerkennung, der R...

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Main Author: Koch, Verena
Contributors: Essen, Lars-Oliver (Prof. Dr. ) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2010
Chemie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Von allen Mitgliedern der STAT-Familie ist die Signaltransduktion durch den Trans-kriptionsfaktor STAT1 bislang am besten untersucht, trotzdem sind noch viele Fragen bezüglich des Mechanismus einer effektiven Zielgenaktivierung offen. Insbesondere die molekularen Schritte der Zielgenerkennung, der Rekrutierung von Koaktivatoren und der Regulation der DNA-Bindung sind nur unvollständig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmalig STAT1-Mutanten generiert, die eine höhere Affinität zu ihren spezifischen palindromischen DNA-Bindestellen (GAS-Stellen) bzw. eine verbesserte kooperative DNA-Bindung aufweisen. Diese DNA-Bindemutanten wurden als nützliche Werkzeuge zum Studium der Zielgenaktivierung eingesetzt. Durch Mutation zweier Glutaminsäurereste in der DNA-Bindedomäne konnte ein molekularer Mechanismus aufgedeckt werden, wodurch phosphorylierte STAT1-Dimere von DNA dissoziieren und damit transkriptionelle Antworten positiv kontrollieren. Beide Aminosäuren kontaktieren das Phosphodiester-Rückgrat der DNA und fungieren als molekularer Schalter, der sequenzunabhängig gebundene Dimere von DNA freisetzt. Durch Einführen von zwei Punktmutationen lässt sich die Dissoziation von DNA inhibieren, dies wirkt sich in einem vergrößerten Repertoire an möglichen Bindestellen auf DNA und einer verstärkten Bindung an hoch-affinen GAS-Stellen aus. Trotz verbesserter GAS-Bindung und einem erhöhten Level an phosphorylierten STAT1-Dimeren im Zellkern ist die transkriptionelle Aktivität nach IFNγ-Stimulation signifikant reduziert. Diese verminderte Genaktivierung erklärt sich zum einen durch unspezifische DNA-Bindung außerhalb von kanonischen GAS-Stellen, zum anderen durch eine verminderte Austauschreaktion an den Promotoren der Zielgene. Eine hohe Dissoziationsrate von DNA ist daher ein Schlüsselfaktor der STAT1-vermittelten Sig-naltransduktion, der erklärt, warum hyperphosphorylierte STAT1-Mutanten mit erhal-tener GAS-Diskriminierung und erhöhter DNA-Bindeaktivität schlechtere Transkriptionsaktivatoren als das Wildtyp-Protein sind. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass eine nukleäre Akkumulation für die Genaktivierung entbehrlich ist. Weiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Mutationen in der N-Domäne identifiziert, die in einer verbesserten kooperativen DNA-Bindung resultierten. Diese zweite Kategorie von DNA-Bindemutanten mit erhaltener GAS-Diskriminierung zeigt eine differentielle Genaktivierung, deren Transkriptionsrate von der Anzahl und Affinität der im Promotor vorhandenen GAS-Stellen abhängt. Mit Hilfe dieser Mutanten konnten erstmalig die Auswirkungen verbesserter Tetramerstabilisierung auf die transkriptionelle Aktivität untersucht werden. Ein erhöhtes Transkriptionsniveau wurde an Genen mit mehrfachen GAS-Bindestellen beobachtet; die Zielgenaktivierung an einfachen GAS-Stellen durch verbesserte kooperative DNA-Bindung zeigt sich differentiell. Klinische Hinweise darauf, dass solche dysfunktionalen DNA-Bindemutationen von STAT1 krankheitsrelevant sind, konnten in kleineren Stichproben von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (n=235) und verschiedenen Leukämieentitäten (n=25) nicht gefunden werden.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2010.0121